Információ

Mi a transzgén integráció mechanizmusa (az expressziós vektortól a gazda genomig)?

Mi a transzgén integráció mechanizmusa (az expressziós vektortól a gazda genomig)?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hogyan integrálódik egy transzgén (a vektorban) a gazda genomjába? (pl. üveggyöngy-módszerben sem biolisztikus, sem nem agrobaktérium).

Már kivágtam néhány részét (NdeI-PciI) a vektorból (pUC18), és kíváncsi vagyok, hogy ez befolyásolja-e az integrációs eljárást. Létezik olyan rekombinációhoz hasonló eljárás, mint az átjáró?


Mi a házigazdád ebben az esetben? A baktérium genomjába való integrációhoz „integrációs” vektort kell használnia. A legtöbb kereskedelmi vektor (például a pUC18) megmarad anélkül, hogy beépülne a gazda genomjába.

Íme a Bacillus Genetic Stock Center integrációs vektorának leírása, amely képet ad arról, hogyan integrálódna az idegen DNS a Bacillus genomba:

Az integrációs vektorok olyan plazmidok, amelyek feltételes replikációt tartalmaznak, szelektálható markerrel összekapcsolva. Ha a plazmidot megfelelő gazdaszervezetbe olyan körülmények között transzformáljuk, amelyek a plazmid jelenlétét szelektálják, de korlátozzák replikációját, akkor minden transzformáns integrálta a plazmidot a kromoszómájába (vagy más, a szelektív körülmények között replikálódni képes rezidens DNS-be). A gyakorlatban a szelektálható marker általában az antibiotikum-rezisztenciát határozza meg. A feltételes replikáció általában azt jelenti, hogy a plazmidnak olyan replikációs funkciói vannak, amelyek E. coliban működnek, Gram-pozitív baktériumokban, például B. subtilisben azonban nem. Néha hőmérséklet-érzékeny replikációs fenotípust alkalmaznak helyette. Az integráció a kromoszóma egy adott lókuszát célozza meg azáltal, hogy azonos szekvenciákat tartalmaz a plazmidban. Ha egyetlen homológ szekvencia létezik, egyetlen keresztezés a teljes kromoszómát egy Campbell-típusú mechanizmussal integrálja a céllókuszba. Ha két homológ szekvencia van, és ezek viszonylag közel vannak egymáshoz a kromoszómán, akkor a kettős keresztezés eredményeként egy kazetta integrálódik a kromoszómális célpontok közé. (forrás)

A legtöbb rutin molekuláris biológiai labormunka esetében nincs szükség géneknek az E. coli genomba történő integrálására. Az integrációt általában "knockout" sejtvonalak létrehozására használják, hogy tanulmányozzák a génműködést a kérdéses baktériumokban.


Ötödik fejezet – Tartós expresszió DNS vektorokból

A DNS-vektorok potenciálisan hatékony orvosi eszközökké válhatnak az emberi betegségek kezelésében. Az emberi szervezet azonban számos védekező stratégiát dolgozott ki az idegen vagy rosszul elhelyezett DNS kimutatására és elhallgatására, ami jellemzően fertőzés vagy kromoszómakárosodás során fordul elő. Egy klinikailag releváns humán génterápiás vektornak le kell győznie vagy el kell kerülnie ezeket a védelmet, miközben a terápiás géntermék tartós szintjét szállítja anélkül, hogy veszélyeztetné a befogadó gazdaszervezet vitalitását. Sok nem vírusos DNS-vektor váltja ki ezeket a védekezési mechanizmusokat, és ezt követően megsemmisül vagy elnémul. Így módosítás vagy átgondolt tervezés nélkül egy tipikus DNS-vektor klinikai használhatósága alapvetően korlátozott a transzgén expressziójának átmeneti jellege miatt. A biztonságos és tartósan expresszáló DNS-vektorok kifejlesztése kulcsfontosságú előfeltétele annak sikeres klinikai alkalmazásának, ezért továbbra is a nem vírusos génterápiás kutatások egyik fő stratégiai feladata marad.

Ebben a fejezetben leírjuk jelenlegi ismereteinket a DNS-vektorok elpusztítására vagy elnémítására alkalmas mechanizmusokról, és megvitatjuk azokat a stratégiákat, amelyeket a fenntartásuk, valamint a transzgén expressziójuk szintjének és időtartamának javítására használtak.


A transzgén donorok in vivo hasítása elősegíti a nukleázok által közvetített célzott integrációt †

A szerzők szeretnék tudni, hogy véleményük szerint az első két szerzőt közös első szerzőnek kell tekinteni.

Absztrakt

A célzott DNS-integrációt általában a transzgénexpresszióra gyakorolt ​​pozícióhatások kiküszöbölésére használják. Az integráció a genom specifikus helyeire irányulhat mind homológia-alapú, mind homológia-független folyamatokon keresztül. Mindkét út az integrációs folyamatot a kromoszóma helyspecifikus megszakadásával indítja el, jellemzően egy cink-ujj nukleázból (ZFN). Korábban leírtunk egy hatékony, homológiától független célzott integrációs technikát, amely rövid (<100 bp) DNS-darabokat rögzít a ZFN-ek által létrehozott kromoszómatöréseknél. Itt megmutatjuk, hogy egy nukleáz célhely beépítése a donor plazmidba, majd a donor és a kromoszóma in vivo nukleázos hasítása nagy, transzgén méretű DNS-molekulák hatékony integrációját eredményezi a kromoszómális kettős szálú törésbe. Az in vivo donor linearizáción keresztüli sikeres célzott integrációt öt különböző lókuszban mutatják be két emlős sejttípusban, kiemelve a megközelítés általánosságát. Végül megmutatjuk, hogy a CHO sejtek, a homológia alapú integrációval szemben ellenálló sejttípus, jártasak az in vivo linearizált transzgén donorok befogásában. Ezenkívül bemutatjuk a hörcsög kiütését FUT8 gén egy antitest-kazetta egyidejű ZFN- vagy TALE-nukleáz-közvetített integrációján keresztül. Eredményeink lehetővé teszik a hatékony, célzott transzgén hozzáadását olyan sejtekhez és organizmusokhoz, amelyek rosszul teljesítenek a hagyományos homológia-vezérelt megközelítésekkel. Biotechnol. Bioeng. 2013, 110: 871–880. © 2012 Wiley Periodicals, Inc.

További támogató információk a cikk online verziójában találhatók.

Fájl név Leírás
bit_24733_sm_SupplFig1.tif4,9 MB Kiegészítő 1. ábra
bit_24733_sm_SupplFig2.tif418.5 KB Kiegészítő 2. ábra
bit_24733_sm_SupplFig3.tif695.8 KB Kiegészítő 3. ábra
bit_24733_sm_SupplTabs.doc94,5 KB Kiegészítő táblázatok
bit_24733_sm_SupplFigsLegend.doc20,5 KB Kiegészítő ábrák Jelmagyarázat

Kérjük, vegye figyelembe: A kiadó nem vállal felelősséget a szerzők által biztosított támogató információk tartalmáért vagy működéséért. Minden kérdéssel (a hiányzó tartalom kivételével) a cikk megfelelő szerzőjéhez kell fordulni.


Absztrakt

A rekombináns emlőssejtek a fő gazdák a fehérjeterápiás szerek előállításában. A termékgén magas expressziója mellett a hipertermelőnek az anyagcserével, a fehérjeszekrécióval és a növekedés szabályozásával kapcsolatos kiváló fenotípusos tulajdonságokkal is rendelkeznie kell. A releváns hiperproduktivitási tulajdonságokat felruházó gének bevezetése gyakran alkalmazott stratégia a termelékenység fokozására. A legtöbb ilyen sejtfejlesztési erőfeszítést konstitutív expressziós rendszerek alkalmazásával hajtották végre. A sejtek azonban dinamikusan reagálnak a különféle környezeti jelzésekre és sejtes eseményekre a sejtszükségleteknek megfelelően. Az indukálható rendszerek használata lehetővé teszi az időfüggő expressziót, de külső manipulációt igényel. Ideális esetben a transzgén expressziójának szinkronban kell lennie a gazdasejt saját ritmusával, és a célnak megfelelő szinten kell lennie. Ebből a célból azonosítottunk különböző expressziós dinamikával és intenzitási tartományokkal rendelkező géneket az egyesített transzkripciós adatok segítségével. Promotereik felhasználhatók a transzgének expressziójának irányítására a kívánt dinamikát követve. Izoláltuk a Thoredoxin-interacting protein (Txnip) gén promóterét, és kimutattuk, hogy képes a transzgén expressziójára a sejtnövekedéssel összhangban. Ezt a kínai hörcsög promótert alkalmaztuk továbbá az egér GLUT5 fruktóz transzporter dinamikus expressziójának megtervezésére kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben, lehetővé téve számukra, hogy a cukrot a sejtszükségleteknek megfelelően használják fel, nem pedig feleslegben, ahogy az általában a tenyészetben látható. Így kevesebb laktát termelődik, ami jobb növekedési sebességet, hosszabb tenyésztési időtartamot és magasabb terméktitert eredményezett. Ez a megközelítés az anyagcsere-mérnökség új koncepcióját szemlélteti, amely potenciálisan felhasználható a sejtek viselkedésének dinamikus szabályozására a fokozott folyamatjellemzők érdekében.


Követelések

1. Génvektor, amely transzgén tranziens expressziójára adaptálva van perifériás szervsejtben, és amely egy transzgénhez működőképesen kapcsolt szabályozó szekvenciát tartalmaz, ahol a szabályozó szekvencia megakadályozza vagy csökkenti az említett transzgén expresszióját hematopoietikus sejtvonal sejtekben.

2. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a szabályozó szekvencia egy vagy több célszekvenciát tartalmaz egy miRNS-szekvenciához.

3. Az 1. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor egy integrációhibás retrovirális vektor.

4. Az 1. igénypont szerinti vektor, ahol a vektor egy integrációhibás lentivírus vektor (IDLV vektor).

5. A 4. igénypont szerinti vektor, amelyben az IDLV vektor HIV-ből származik.

6. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben az egy vagy több célszekvencia mindegyike egymástól függetlenül a miR-142, miR-155 és miR-223 által megcélzott szekvencia közül van kiválasztva.

7. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a célszekvencia egy miR-142 által megcélzott szekvencia.

8. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a célszekvencia egy miR-155 által megcélzott szekvencia.

9. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a célszekvencia egy miR-223 által megcélzott szekvencia.

10. A 7. igénypont szerinti vektor, amelyben a szabályozó szekvencia a miR-142 célszekvencia négy másolatát tartalmazza.

11. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a célszekvencia teljesen vagy részben komplementer a miRNS-szekvenciával.

12. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a transzgéntermék egy terápiás fehérje.

13. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a transzgéntermék egy antigén.

14. A 13. igénypont szerinti vektor, amelyben az antigén egy endogén antigén, egy exogén antigén, egy alloantigén és egy autoantigén által alkotott csoportból van kiválasztva.

15. A 14. igénypont szerinti vektor, amelyben az antigén egy exogén antigén.

16. Az 1. igénypont szerinti vektor, amelyben a transzgén működőképesen kapcsolódik egy szövetspecifikus promoterhez.

17. A 16. igénypont szerinti vektor, amelyben a szövetspecifikus promoter egy perifériás szervben lévő sejtre specifikus promoter.

18. A 17. igénypont szerinti vektor, amelyben a perifériás szerv a máj, az izom, a csecsemőmirigy, a lép és a nyirokcsomók által alkotott csoportból van kiválasztva.

19. A 16. igénypont szerinti vektor, amelyben a szövetspecifikus promoter egy hepatospecifikus promoter.

20. A 16. igénypont szerinti vektor, amelyben a szövetspecifikus promoter az albumin promoter, transz-tiretin promoter, alfa1-antitripszin promoter, szintetikus apoE/alfa1-antitripszin promoter és szintetikus ET promoter közül választott promoter.

21. Az 1. igénypont szerinti vektor, ahol a vektor vírusvektor részecske formájában van.

22. DNS-konstrukciók készlete 21. igénypont szerinti vektorrészecske előállítására, amely csomagolható vektorgenomot, gag-et, pol-t és env-t vagy ezek funkcionális helyettesítőit tartalmazza.

23. A 22. igénypont szerinti DNS-konstrukciók készlete, ahol az említett konstrukciók hibás integrázt kódolnak.

24. A 22. igénypont szerinti DNS-konstrukciók készlete, ahol a konstrukciók olyan módosított LTR-helyeket tartalmaznak, amelyekben a megváltozott LTR-helyek megakadályozzák a lentivírus vektor genomjának integrációját.

25. Gyógyászati ​​készítmény, amely az 1. igénypont szerinti vektort vagy részecskét tartalmazza.

26. Az 1. igénypont szerinti vektorral vagy részecskével fertőzött vagy transzdukált sejt.

27. Az 1. igénypont szerinti vektor vagy részecske antigén elleni immunológiai tolerancia kiváltására vagy fokozására történő alkalmazásra egy alanyban.

28. Az 1. igénypont szerinti vektor vagy részecske, ahol az antigén egy fehérjepótló terápia részeként beadott exogén antigén.

29. Az 1. igénypont szerinti vektor vagy részecske autoimmun betegségek, allergiás betegségek, immunmediált betegségek és graft vs. host betegség által alkotott csoportból választott betegség kezelésében vagy megelőzésében történő alkalmazásra.

30. Eljárás alanyban tolerancia kiváltására, azzal jellemezve, hogy az alanynak az 1. igénypont szerinti vektort vagy részecsket adjuk be, azzal jellemezve, hogy a tolerancia a transzgén által expresszált termékre vonatkozik.


A CRISPR/Cas9 génszerkesztés alkalmazása a madároltóanyagok fejlesztésében

Számos megközelítést alkalmaztak vírusvektorok szerkesztésére baromfivírusok elleni rekombináns vakcinajelöltek készítésére (Baron et al., 2018). A vírusvektoros vakcinák módosítására jelenleg rendelkezésre álló módszerek nem hatékonyak, idő- és munkaigényesek, különösen a tisztítási eljárások esetében (Zou et al., 2017). Ezért sürgősen szükség van egy hatékonyabb és megbízhatóbb genomszerkesztési technológiára a vírusvektoros vakcinák kifejlesztéséhez. A CRISPR/Cas9 genomszerkesztési megközelítés a legjobb választás, mivel nem csak alternatív könnyű és egyszerű megközelítést kínál a hagyományos megközelítésekhez képest, hanem lehetőséget ad többértékű rekombináns vakcinák előállítására, amelyek egyidejű védelmet nyújtanak a főbb madárbetegségek ellen.

Eddig a CRISPR/Cas9-et sikeresen alkalmazták különböző vírusvektorok célzott mutagenezisében, beleértve a pulyka herpeszvírusát (HVT) (Tang és mtsai, 2018, 2020 Chang és mtsai, 2019), a fertőző laringotracheitisz vírust (ILTV) (Atasoy et al. al., 2019) és a kacsa enteritisz vírusa (DEV) (Zou et al., 2017 Chang et al., 2018). Ezeket a rekombináns vírusvektor-genomokat úgy szerkesztették, hogy specifikus antigéneket tároljanak és expresszáljanak potenciális vírus-vektorolt ​​vakcinákként többféle betegség ellen, mint például az NDV (Atasoy et al., 2019), az AIV (Zou és mtsai, 2017 Chang és mtsai, 2019), MD (Tang et al., 2018, 2020) és az ILTV (Tang et al., 2020). Hasonlóképpen a in vitro ezeknek a rekombináns vakcináknak a hatékonyságát és stabilitását többszörös sejtpasszáláson keresztül értékelték a klasszikus módszerekkel összehasonlítva, ahol a transzgén instabilitása többszörös passzázs eredménye lehet (Zou és mtsai, 2017 Tang és mtsai, 2018, 2020 Atasoy et al., 2019 Chang et al. ., 2019). Ezen konstrukciók/kazetták stabilitásának meghatározásához a rekombináns vírusok folyamatos sejtpasszálása során legalább a 15. passzázsig, és az inszertek stabilitását és expresszióját Western immunoblot-vizsgálattal, immunfluoreszcenciával és molekuláris kimutatással igazoltuk (Tang et al., 2018, 2020 Atasoy et. al., 2019 Chang et al., 2019). Ezért ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy a CRISPR/Cas9 hatékony, gyors és egyszerű eszköz a madárvakcinák kifejlesztéséhez. A CRISPR/Cas9 alkalmazásainak áttekintése a madárvírus-vakcinák felépítésében a 2. táblázatban található, és az alábbiakban minden egyes vírus esetében külön tárgyaljuk.

2. táblázat. A CRISPR/Cas9 alkalmazásainak áttekintése a madárvírus-vakcinák felépítésében.

Newcastle-betegség vírus (NDV)

A Newcastle-betegség vírusa (NDV) az egyik legfontosabb madárvírus-kórokozó, amely világszerte jelentős gazdasági veszteségeket okoz (Alexander, 2001 Zahid et al., 2020). Az NDV genetika és biológia rendkívül összetett, jelenleg több mint 20 filogenetikailag eltérő genotípust javasolnak a taxonómiai osztályozás alapján (Dimitrov et al., 2019). A hatékony ND elleni vakcina kialakítására irányuló folyamatos erőfeszítések ellenére még mindig szükség van a fejlesztésekre. Ebben a folyamatban az NHEJ-CRISPR/Cas9 rendszer a Cre/lox rendszerrel együtt hatékony megközelítést kínál az új ND vakcinák javítására és fejlesztésére. Kimutattuk a fertőző laringotracheitisz vírus (ILTV) biztonságosságát és hatékonyságát, mint a velogén NDV fúziós (F) génjét tartalmazó vakcina vektort, és bemutattuk az NHEJ-CRISPR/Cas9 és a Cre/Lox rendszer sokoldalúságát (Atasoy et al., 2019). ). Ezekben a kísérletekben töröltük a timidin kinázt (TK) és egyedi rövid 4 (US4) géneket az ILTV genomból, és az NDV GFP riportergénjére, illetve F génjére cserélték, az NHEJ-CRISPR/Cas9 rendszert használva két fő madár légúti vírus (ILTV és NDV) elleni bivalens vakcinajelölt megalkotására. Így arra a következtetésre jutottunk, hogy a transzgén beépítése az ILTV genomba CRISPR/Cas9 segítségével, majd a markergének Cre–Lox rendszerrel történő kivágása hatékony módszer a gének stabil expressziójára anélkül, hogy káros hatást gyakorolna a vírus vakcina vektor replikációjára (Atasoy et al. ., 2019).

Madárinfluenza vírus (AIV)

A magas patogenitású madárinfluenza vírusok (AIV) széles körű elterjedése jelentős gazdasági veszteségeket okoz a baromfiágazatban, miközben tartós pandémiás veszélyt jelent e vírusok időnkénti emberre való átterjedése (Peiris et al., 2007). Az AIV-k jelenlegi vakcinázási stratégiái inkább megelőző intézkedésként szolgálnak a madarak vírusfertőzése ellen, nem pedig a felszámolása (Collett et al., 2020 Irshad et al., 2020). E vakcinázási stratégiák jelenlegi hatékonysága ellenére azonban a madarak fogékonyak az influenza A vírusokra (Collett et al., 2020). A CRISPR/Cas9-et a madárinfluenza-vírus specifikus altípusai elleni vírusalapú vakcinák kifejlesztésére használták. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a CRISPR/Cas9 rendszert hatékony és hatékony eszközként használják a kacsa enteritisz vírus (DEV) célzott genomtervezésére, hogy olyan vakcinajelöltet állítsanak elő, amely expresszálja a magas patogenitású H5N1 madárinfluenza vírus hemagglutinin (HA) fehérjét (Zou et al. ., 2017). Ezen túlmenően ez a rekombináns DEV vakcina a kacsa tembusu vírus (DTMUV) két további génjét [premembrán fehérjéket (PrM) és burok glikoprotein (E) géneket] is tartalmaz, amelyek háromértékű vakcinajelöltet hoznak létre a H5N1, DEV és DTMUV fertőzések ellen. kacsák.

A CRISPR-hez kapcsolódó Cas9 helyspecifikus genom-mérnökséget ér el, és kettős száltörést (DSB) vezethet be a vezető RNS által meghatározott kromoszómális helyen (Cong et al., 2013 Jinek et al., 2013 Mali et al., 2013a). A DSB vagy nem homológ végcsatlakozással (NHEJ) vagy homológ-irányított javítási (HDR) úton javítható. A HDR útvonal homológ donor DNS-szekvenciákat használ testvérkromatidákból vagy idegen DNS-ből pontos inszerciók, a DSB helyek vagy két DSB közötti egyszerű szubsztitúciók és egyéb módosítások előállításához, míg az NHEJ útvonal megfelelő deléciókat és inszerciókat hoz létre (Tang et al., 2019). . Az NHEJ útvonal a DNS-javító mechanizmus egyik fő típusa, klasszikus és alternatív útvonalakra oszlik, amelyek sikeresen összekapcsolják a törött DNS-t (Mao et al., 2008). Az NHEJ' alacsony hűsége, amely valószínűleg hibára hajlamos, a javítás után bázisdeléciót vagy -beillesztést (indel) eredményezhet, ami frameshift mutációt eredményez (Bernheim et al., 2017). Az NHEJ az uralkodó DSB-alapú javítási útvonal, és a legtöbb sejtciklus DSB-javításáért felelős (Arnoult et al., 2017).

Eközben a CRISPR/Cas9 hibamentes homológia-irányított javítás (HDR) megközelítést alkalmazták a HVT-AIV bivalens vakcina előállítására, és a rekombináns HVT-HA kiválasztása egy precíz, egyszerű és gyors eritrocita adszorpciós teszt kifejlesztésével történt. a hagyományos megközelítések alkalmazása helyett (Chang et al., 2019). Ez a folyamat hozzávetőlegesen ߦ%-os pontosságot eredményezett a H7N9 HA beillesztésénél, ami azt jelzi, hogy az NHEJ közvetítette a GFP-negatív HVT vírusok többségének elhallgatását (Chang et al., 2019). A CRISPR/Cas9 által közvetített DSB-k NHEJ és HDR útvonalon is áthaladhatnak, de a legtöbb esetben az NHEJ-t részesítik előnyben (Frit et al., 2014), így az NHEJ által közvetített csend lehetősége igazolható.Míg a HDR egy hűséges út, és képes ösztönözni a hibamentes javítási mechanizmust, fokozni kell a hatékonyságát.

Marek'-es betegségvírus (MDV)

A Marek's betegségvírus (MDV) a csirkék limfoproliferatív betegsége, amelyet 1969 óta elsősorban vakcinázással kontrollálnak (Okazaki et al., 1970). Turkey's herpeszvírusok (HVT), amelyek a Meleagrid herpesvírus 1, több mint 40 éve széles körben alkalmazzák a Marek-kór (MD) elleni vakcinaként (Okazaki et al., 1970). A közelmúltban a HVT-t vírusvektorként használják MD és más vírusos betegségek elleni védő immunitás biztosítására azáltal, hogy más vírusos betegségek idegen vírusantigénjeit hordozza és expresszálja (Li et al., 2011 Vagnozzi et al., 2012 Esaki et al., 2013 Chang). et al., 2019). A CRISPR/Cas9 technológia forradalmasította a HVT-vakcina felépítését és a HVT-ben rejlő lehetőségeket a multivalens vakcinák vektoraként. Tang és munkatársai sikeresen létrehoztak egy rekombináns HVT-t hármas géninszertekkel, ami egy rekombináns vírusvakcina-jelölt kifejlesztéséhez vezetett, amely potenciálisan védelmet indukálhat három fő madárvírus-betegség (ILTV, IBDV, AIV, MDV) ellen, 2. táblázat Tang et al., 2020). Hasonlóképpen Chang és mtsai. A HDR-CRISPR/Cas9-et használta az influenza A vírus hemagglutinin (HA) antigénjét expresszáló rekombináns bivalens HVT vakcina kifejlesztésére (Chang et al., 2019).

Fertőző laringotracheitisz vírus (ILTV)

A fertőző laringotracheitisz vírus (ILTV) egy légúti betegség, amely a baromfiipart érinti, és világszerte gazdasági hatással bír (Gowthaman et al., 2020). által okozott fertőző laringotracheitis (ILT) betegség Gallid herpsvírus típus 1 (GaHV-1), és fertőzött madarakon és fomitokon keresztül terjedhet (Davison et al., 2009). Az attenuált és rekombináns vírus-vektorolt ​​vakcinákkal végzett vakcinázás az endémiás régiókban alkalmazott elsődleges védekezési intézkedés (Collett et al., 2020). A stabilabb vakcinatörzsek kifejlesztése érdekében a CRISPR/Cas9 technológiát sikeresen alkalmazták egy ILTV antigént expresszáló rekombináns vírusvektor létrehozására (2. táblázat). Tang et al. CRISPR/Cas9 génszerkesztési megközelítést alkalmaztak az ILTV glikoprotein D-glikoprotein I (gD-gI) expressziós kazettájának beütésére a HVT genomon belül egy specifikus régióba (Tang et al., 2020). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a CRISPR/Cas9 génszerkesztési megközelítés képes volt a HVT genomot egy adott régióban levágni, és az ILTV gD-gI expressziós kazettát homológia-független NHEJ javító rendszeren keresztül beilleszteni. A szerzőknek két további antigént is sikerült beépíteniük és expresszálniuk a rekombináns HVT genom különböző helyeire, és így stabil háromértékű rekombináns HVT vakcinát fejlesztettek ki.


Klónozási módszerek

Az GATEWAY klónozási technológia az l-es fág által használt helyspecifikus rekombinációs rendszeren alapul, hogy DNS-ét a E. coli kromoszóma. Mindkét organizmusnak van specifikus rekombinációs helye, az úgynevezett attP a fág l helyén és attKuka E. coli. Az integrációs folyamatot (lizogén) 2 enzim katalizálja: az l-es fág által kódolt Int fehérje (Integrase) és a E. coli protein IHF (Integration Host Factor). Integrációkor a közötti rekombináció attB (25 nt) és attP (243 nt) helyek generálnak attL (100 nt) és attR (168 nt) helyek, amelyek az integrált fág l DNS-t szegélyezik (lásd az 1. ábrát).

A folyamat reverzibilis, és a kimetszés ismét Int és IHF katalizálódik a Xis fág 1 fehérjével kombinálva. Az attL és attAz inszertált fág DNS-t körülvevő R helyek helyspecifikusan rekombinálódnak a kivágás során, hogy megreformálják a attP hely az l-es fágban és a attB oldalon a E. coli kromoszóma.

Az GATEWAY reakciók vannak in vitro az integrációs és kivágási reakciók változatai. A reakciók irányíthatósága érdekében két kissé eltérő és specifikus helyet alakítottak ki, att1 és att2 minden rekombinációs helyhez. Ezek az oldalak nagyon konkrétan reagálnak egymásra. Például a BP reakció attA B1 csak azzal reagál attP1 eredménye attL1 és attR1, és attB2 csak attP2 adás attL2 és attR2. A fordított reakció (LR reakció) ugyanazt a specifikusságot mutatja.

A GATEWAY reakciók végső célja egy expressziós klón létrehozása. Ez gyakran kétlépéses folyamat:

1. lépés Az érdeklődésre számot tartó gén klónozása egy Bejegyzés vektor használni a BP reakció.
2. lépés A kívánt gén szubklónozása az Entry Clone-ból (1. lépés) a Cél vektor használni a LR reakció előállítása a Expression Clone.

Nézzük meg közelebbről a LR reakció lépés (lásd még a 2. ábrát). Az érdeklődésre számot tartó gént egy Bejegyzés vektor és mellette a attL1 és attL2 rekombinációs helyek. Az Bejegyzés vektor transzkripciósan csendes, és tartalmazza a kanamicinrezisztencia génjét (Km r). Előállítani a Expression Clone a gént szubklónozni kell a Cél vektor amely tartalmazza az expresszióhoz szükséges összes szekvencia információt, az ampicillinrezisztencia génjét (Ap r ) és két rekombinációs helyet (attR1 és attR2), amelyek egy negatív szelekciós gént szegélyeznek, ccdB (a kódolt fehérje mérgező a standard számára E. coli törzsek).

A két plazmidot összekeverjük és a LR C LONASE Enzimkeverék hozzáadva. A reakció irányított és specifikus, tehát attAz L1 csak azzal reagál attR1 és attL2-vel attR2. A rekombináció két konstrukciót eredményez: a szándékolt Expression Clone és egy melléktermék (a 2. ábrán a következővel jelölve). donor vektor). Az előállított expressziós klón két szelekciós formája alatt áll: az antibiotikum-rezisztencia és a toxikus ccdB fehérje negatív szelekciója. Ennek eredményeként a pozitív klónok magas szintje (általában több mint 99%) érhető el standard klónozó vagy expressziós törzsbe, például DH5a vagy BL21 (DE3) történő transzformáció után.

Az egyik fő előnye a GATEWAY klónozási technológia hogy ha egyszer elkészített egy Entry Clone a kérdéses gén könnyen szubklónozható sokféle Cél vektorok használni a LR reakció (lásd 3. ábra).

Ha többet szeretne tudni a GATEWAY klónozási technológia látogasson el az Invitrogen webhelyére.


Tartalom

Átírás szerkesztése

A DNS-szálból egy RNS-másolat előállítását transzkripciónak nevezik, és az RNS-polimerázok végzik, amelyek a nukleotidbázisok komplementaritási törvényének megfelelően egy-egy ribonukleotidot adnak a növekvő RNS-szálhoz. Ez az RNS komplementer a templát 3′ → 5′ DNS-szálhoz, [7] azzal az eltéréssel, hogy a timineket (T) uracilokkal (U) helyettesítik az RNS-ben.

A prokariótákban a transzkripciót egyetlen típusú RNS-polimeráz végzi, amelynek a szigma faktor fehérje (σ faktor) segítségével meg kell kötnie a Pribnow-boxnak nevezett DNS-szekvenciát a transzkripció elindításához. Az eukariótákban a transzkripciót a sejtmagban háromféle RNS-polimeráz végzi, amelyek mindegyikéhez speciális DNS-szekvenciára, úgynevezett promoterre és DNS-kötő fehérjékre – transzkripciós faktorokra – van szükség a folyamat elindításához (lásd alább a transzkripció szabályozását). . Az RNS polimeráz I felelős a riboszómális RNS (rRNS) gének transzkripciójáért. Az RNS-polimeráz II (Pol II) átírja az összes fehérjét kódoló gént, de néhány nem kódoló RNS-t is.például.snRNS-ek, snoRNS-ek vagy hosszú, nem kódoló RNS-ek). Az RNS polimeráz III átírja az 5S rRNS-t, transzfer RNS (tRNS) géneket és néhány kis, nem kódoló RNS-t (például., 7SK). A transzkripció akkor ér véget, amikor a polimeráz találkozik a terminátornak nevezett szekvenciával.

MRNS feldolgozás Szerk

Míg a prokarióta fehérjét kódoló gének transzkripciója hírvivő RNS-t (mRNS) hoz létre, amely készen áll a transzlációra fehérjévé, az eukarióta gének transzkripciója az RNS elsődleges transzkriptumát (pre-RNS) hagyja maga után, amelyet először egy sor módosításon kell keresztülvinni ahhoz, hogy érett RNS. Az érési folyamatok típusai és lépései a kódoló és a nem kódoló preRNS-ek között változnak azaz bár az mRNS és a tRNS preRNS-molekulái splicingen mennek keresztül, a lépések és a gépezet eltérőek. [8] A nem kódoló RNS feldolgozását az alábbiakban ismertetjük (nem magképző RNS érése).

A premRNS feldolgozása magában foglalja az 5′ sapkázás, amely olyan enzimreakciók összessége, amelyek 7-metilguanozint (m 7 G) adnak a pre-mRNS 5′ végéhez, és így megvédik az RNS-t az exonukleázok általi lebomlással szemben. Az m 7 G-sapkát ezután cap-kötő komplex heterodimer (CBC20/CBC80) köti meg, amely elősegíti az mRNS citoplazmába történő exportját, és megvédi az RNS-t a kupak lebontásától.

Egy másik módosítás a 3′ hasítás és poliadeniláció. Akkor fordulnak elő, ha poliadenilációs szignálszekvencia (5'-AAUAAA-3') jelen van a pre-mRNS-ben, amely általában a fehérjét kódoló szekvencia és a terminátor között van. Először a pre-mRNS-t hasítják, majd egy sorozatot

200 adenint (A) adnak hozzá a poli(A) farok kialakításához, amely megvédi az RNS-t a lebomlástól. A poli(A) farkat több poli(A)-kötő fehérje (PABP) köti, amelyek az mRNS-exporthoz és a transzláció újrakezdéséhez szükségesek. A deadeniláció inverz folyamatában a poli(A)-farkat a CCR4-Not 3'-5' exonukleáz lerövidíti, ami gyakran a transzkriptum teljes bomlásához vezet.

Az eukarióta pre-mRNS nagyon fontos módosítása az RNS splicing. Az eukarióta pre-mRNS-ek többsége váltakozó szegmensekből, úgynevezett exonokból és intronokból áll. A spliceosome néven ismert RNS-protein katalitikus komplex a spliceosome-ként ismert spliceosoma folyamat során két átészterezési reakciót katalizál, amelyek egy intront eltávolítanak és lariát szerkezet formájában felszabadítják, majd a szomszédos exonokat összekapcsolják. Bizonyos esetekben egyes intronok vagy exonok eltávolíthatók vagy megmaradhatnak az érett mRNS-ben. Ez az úgynevezett alternatív splicing egyetlen génből származó különböző transzkriptumok sorozatát hozza létre. Mivel ezek a transzkriptumok potenciálisan különböző fehérjékké fordíthatók, a splicing kiterjeszti az eukarióta génexpresszió összetettségét és a fajproteómák méretét.

A kiterjedt RNS-feldolgozás evolúciós előnyt jelenthet, amelyet az eukarióták magja tesz lehetővé. A prokariótákban a transzkripció és a transzláció együtt megy végbe, míg az eukariótákban a nukleáris membrán választja el a két folyamatot, így időt adva az RNS feldolgozásra.

Nem kódoló RNS érés Szerk

A legtöbb szervezetben a nem kódoló gének (ncRNS) prekurzorokként íródnak át, amelyek további feldolgozáson esnek át. A riboszómális RNS-ek (rRNS) esetében gyakran pre-rRNS-ként íródnak át, amely egy vagy több rRNS-t tartalmaz. A pre-rRNS-t specifikus helyeken hasítja és módosítja (2′-O-metiláció és pszeudouridin képződés) körülbelül 150 különböző kis nukleolus-korlátozott RNS-fajjal, amelyeket snoRNS-eknek neveznek. A SnoRNS-ek fehérjékhez kapcsolódnak, snoRNP-ket képezve. Míg a snoRNS rész bázispárt alkot a cél RNS-sel, és így a módosítást egy pontos helyre pozícionálja, addig a fehérje rész hajtja végre a katalitikus reakciót. Az eukariótákban, különösen az RNáz nevű snoRNP-ben, az MRP a 45S pre-rRNS-t 28S, 5.8S és 18S rRNS-ekre hasítja. Az rRNS és az RNS feldolgozó faktorok nagy aggregátumokat képeznek, amelyeket nucleolusnak neveznek. [9]

Transzfer RNS (tRNS) esetén például az 5′ szekvenciát az RNáz P [10], míg a 3′ végét a tRNáz Z enzim [11] és a nem templált 3′ CCA farok távolítja el. egy nukleotidil-transzferáz hozzáadja. [12] A mikro-RNS (miRNS) esetében a miRNS-eket először primer transzkriptumként vagy pri-miRNS-ként írják át sapkával és poli-A-farokkal, és rövid, 70 nukleotidból álló szárhurok-struktúrákká dolgozzák fel, amelyek pre-miRNS néven ismertek. a sejtmagot a Drosha és Pasha enzimek segítségével. Exportálás után érett miRNS-ekké dolgozzák fel a citoplazmában a Dicer endonukleázzal való kölcsönhatás révén, amely szintén elindítja az RNS-indukált csendesítő komplex (RISC) kialakulását, amely az Argonaute fehérjéből áll.

Még maguk az snRNS-ek és a snoRNS-ek is számos módosításon esnek át, mielőtt a funkcionális RNP komplex részévé válnának. Ez vagy a nukleoplazmában, vagy a Cajal-testeknek nevezett speciális rekeszekben történik. Bázisukat a snoRNS-ekhez szerkezetileg hasonló kis Cajal testspecifikus RNS-ek (scaRNS-ek) csoportja metilálja vagy pszeudouridinilálja.

RNA export Szerkesztés

Az eukariótákban a legtöbb érett RNS-t a sejtmagból a citoplazmába kell exportálni. Míg néhány RNS a sejtmagban működik, sok RNS a nukleáris pórusokon keresztül a citoszolba kerül. [13] Az RNS-ek exportja specifikus, exportinnek nevezett fehérjékkel való asszociációt igényel. Egy adott RNS-típus exportálásáért specifikus exportin molekulák felelősek. Az mRNS-transzport megköveteli az Exon Junction Complex (EJC) megfelelő társítását is, amely biztosítja, hogy az mRNS megfelelő feldolgozása az exportálás előtt befejeződjön. Egyes esetekben az RNS-ek ezenkívül a citoplazma egy meghatározott részébe, például egy szinapszisba is eljutnak, majd motorfehérjék vonzzák őket, amelyek linker fehérjéken keresztül az RNS-en lévő specifikus szekvenciákhoz (úgynevezett „irányítószámokhoz”) kötődnek. [14]

Fordítás Szerkesztés

Egyes RNS (nem kódoló RNS) esetében az érett RNS a végső géntermék. [15] A hírvivő RNS (mRNS) esetében az RNS egy információhordozó, amely egy vagy több fehérje szintézisét kódolja. Az egyetlen fehérjeszekvenciát hordozó mRNS (gyakori az eukariótákban) monocisztronos, míg a több fehérjeszekvenciát hordozó mRNS (gyakran a prokariótákban) policisztronként ismert.

Minden mRNS három részből áll: egy 5′-os nem transzlált régióból (5′UTR), egy fehérjét kódoló régióból vagy nyílt leolvasási keretből (ORF) és egy 3′-es nem transzlált régióból (3′UTR). A kódoló régió a genetikai kód által kódolt fehérjeszintézishez szükséges információkat hordozza, hogy tripleteket képezzenek. A kódoló régió nukleotidjainak minden egyes hármasát kodonnak nevezzük, és egy kötőhelynek felel meg, amely komplementer az átviteli RNS antikodonhármasával. Az azonos antikodonszekvenciájú transzfer RNS-ek mindig azonos típusú aminosavat tartalmaznak. Az aminosavakat ezután a riboszóma köti össze a kódoló régióban lévő tripletek sorrendjének megfelelően. A riboszóma segít az RNS átvitelében, hogy a hírvivő RNS-hez kötődjön, és minden transzfer RNS-ből kiveszi az aminosavat, és szerkezet nélküli fehérjét készít belőle. [16] [17] Mindegyik mRNS-molekula átlagosan sok fehérjemolekulává alakul át

A prokariótákban a transzláció általában a transzkripció pontján történik (ko-transzkripció), gyakran egy hírvivő RNS felhasználásával, amely még folyamatban van. Az eukariótákban a transzláció a sejt számos régiójában megtörténhet, attól függően, hogy a megírandó fehérjének hol kell lennie. A fő helyek az oldható citoplazmatikus fehérjék citoplazmája és az endoplazmatikus retikulum membránja azon fehérjék számára, amelyeket a sejtből exportálnak vagy a sejtmembránba inszertálnak. Azokat a fehérjéket, amelyeknek az endoplazmatikus retikulumban kell expresszálódniuk, a transzlációs folyamat során felismerik. Ezt a jelfelismerő részecske szabályozza – egy fehérje, amely a riboszómához kötődik, és az endoplazmatikus retikulumhoz irányítja azt, amikor szignálpeptidet talál a növekvő (naszcens) aminosavláncon. [20]

Összecsukható Szerkesztés

Valamennyi fehérje feltekeredett polipeptidként vagy véletlenszerű tekercsként létezik, amikor az mRNS szekvenciájából lineáris aminosavláncokká transzlálódnak. Ez a polipeptid nem rendelkezik fejlett háromdimenziós szerkezettel (a szomszédos ábra bal oldala). A polipeptid ezután egy véletlenszerű tekercsből a jellegzetes és funkcionális háromdimenziós szerkezetébe hajtódik össze. [21] Az aminosavak egymással kölcsönhatásba lépve egy jól körülhatárolható háromdimenziós struktúrát hoznak létre, a natív állapotként ismert, hajtogatott fehérjét (az ábra jobb oldala). Az így létrejövő háromdimenziós szerkezetet az aminosavszekvencia határozza meg (Anfinsen dogma). [22]

A megfelelő háromdimenziós struktúra elengedhetetlen a működéshez, bár a funkcionális fehérjék egyes részei kibontva maradhatnak. [23] Ha nem hajtják össze a kívánt formát, általában inaktív fehérjék keletkeznek, amelyek eltérő tulajdonságokkal rendelkeznek, beleértve a toxikus prionokat is. Úgy gondolják, hogy számos neurodegeneratív és egyéb betegség a felhalmozódás eredménye rosszul hajtogatva fehérjék. [24] Sok allergiát a fehérjék feltekeredése okoz, mivel az immunrendszer nem termel antitesteket bizonyos fehérjeszerkezetekhez. [25]

A chaperonoknak nevezett enzimek segítik az újonnan képződött fehérjét, hogy elérje (behajtja) a működéséhez szükséges háromdimenziós szerkezetet. [26] Hasonlóképpen, az RNS chaperonok segítik az RNS-eket funkcionális formájuk elérésében. [27] Az eukarióták endoplazmatikus retikulumának egyik fő szerepe a fehérje feltekeredésének elősegítése.

Transzlokáció Szerkesztés

Az eukarióták vagy prokarióták szekréciós fehérjéit át kell helyezni, hogy bejussanak a szekréciós útvonalba. Az újonnan szintetizált fehérjéket szignálpeptidek irányítják az eukarióta Sec61 vagy prokarióta SecYEG transzlokációs csatornába. A fehérjeszekréció hatékonysága eukariótákban nagymértékben függ az alkalmazott szignálpeptidtől. [28]

Fehérjeszállítás Szerk

Sok fehérjét a sejt más részeire szánják, mint a citoszolt, és számos jelátviteli szekvenciát vagy (szignálpeptideket) használnak a fehérjék odairányítására, ahol lenniük kell. A prokariótákban ez általában egyszerű folyamat a sejt korlátozott kompartmentalizációja miatt. Az eukariótákban azonban számos különböző célzási folyamat létezik annak biztosítására, hogy a fehérje a megfelelő organellumhoz érkezzen.

Nem minden fehérje marad a sejtben, és sok fehérje exportálódik, például emésztőenzimek, hormonok és extracelluláris mátrixfehérjék. Az eukariótákban az exportút jól fejlett, és e fehérjék exportjának fő mechanizmusa az endoplazmatikus retikulumba történő transzlokáció, amelyet a Golgi-készüléken keresztüli transzport követ. [29] [30]

A génexpresszió szabályozása egy gén funkcionális terméke mennyiségének és megjelenésének időzítésének szabályozására vonatkozik. Az expresszió szabályozása létfontosságú ahhoz, hogy a sejt előállítsa azokat a géntermékeket, amelyekre szüksége van, amikor viszont szüksége van rájuk. Ez rugalmasságot biztosít a sejtek számára, hogy alkalmazkodjanak a változó környezethez, a külső jelekhez, a sejtkárosodáshoz és más ingerekhez. Általánosabban fogalmazva, a génszabályozás biztosítja a sejt számára az ellenőrzést minden szerkezet és funkció felett, és ez az alapja a sejtek differenciálódásának, morfogenezisének, valamint bármely organizmus sokoldalúságának és alkalmazkodóképességének.

Számos kifejezést használnak a gének típusainak leírására attól függően, hogy hogyan szabályozzák őket, ezek a következők:

  • A konstitutív gén egy olyan gén, amely folyamatosan átíródik, szemben a fakultatív génnel, amely csak szükség esetén íródik át.
  • A háztartási gén egy gén, amely az alapvető sejtműködés fenntartásához szükséges, és így jellemzően egy szervezet minden sejttípusában expresszálódik. Ilyen például az aktin, a GAPDH és az ubiquitin. Egyes háztartási gének viszonylag állandó sebességgel íródnak át, és ezek a gének referenciapontként használhatók más gének expressziós sebességének mérésére végzett kísérletekben.
  • A fakultatív gén egy gén, amely csak szükség esetén íródik át, szemben a konstitutív génnel.
  • An indukálható gén egy olyan gén, amelynek expressziója vagy reagál a környezeti változásokra, vagy a sejtciklusban elfoglalt pozíciótól függ.

A génexpresszió bármely lépése módosítható, a DNS-RNS transzkripciós lépéstől a fehérje poszttranszlációs módosításáig. A végső géntermék stabilitása, legyen az RNS vagy fehérje, szintén hozzájárul a gén expressziós szintjéhez – az instabil termék alacsony expressziós szintet eredményez. A génexpressziót általában a molekulák közötti kölcsönhatások számában és típusában bekövetkező változások [31] szabályozzák [32], amelyek együttesen befolyásolják a DNS transzkripcióját [33] és az RNS transzlációját. [34]

Néhány egyszerű példa arra, hogy hol fontos a génexpresszió:

  • Szabályozza az inzulin expresszióját, így jelet ad a vércukorszint szabályozására. nőstény emlősökben a benne lévő gének "túladagolásának" megelőzésére. Az expressziós szintek szabályozzák a progressziót az eukarióta sejtcikluson keresztül.

Transzkripciós szabályozás Szerk

A transzkripció szabályozása három fő útvonalra bontható: genetikai (egy szabályozó faktor közvetlen kölcsönhatása a génnel), egy szabályozó faktor és a transzkripciós gépezet modulációs kölcsönhatása és epigenetikai (a DNS szerkezetének transzkripciót befolyásoló nem szekvenciális változásai) .

A DNS-sel való közvetlen kölcsönhatás a legegyszerűbb és legközvetlenebb módszer, amellyel egy fehérje megváltoztatja a transzkripciós szintet. A gének gyakran több fehérjekötő hellyel rendelkeznek a kódoló régió körül, amelyek specifikus funkciója a transzkripció szabályozása. A szabályozó DNS-kötő helyek számos osztálya ismert fokozók, szigetelők és hangtompítók néven. A transzkripció szabályozásának mechanizmusai nagyon változatosak, a DNS-ben található kulcsfontosságú kötőhelyek blokkolása az RNS-polimeráz számára, az aktivátor szerepe és a transzkripció elősegítése az RNS-polimeráz kötődésének elősegítésével.

A transzkripciós faktorok aktivitását tovább modulálják az intracelluláris jelek, amelyek a fehérje poszttranszlációs módosulását okozzák, beleértve a foszforilált, acetilezett vagy glikozilált fehérjéket. Ezek a változások befolyásolják a transzkripciós faktor azon képességét, hogy közvetlenül vagy közvetve kötődjön a promoter DNS-hez, hogy RNS-polimerázt toborozzon, vagy elősegítse az újonnan szintetizált RNS-molekula megnyúlását.

Az eukarióták sejtmagmembránja lehetővé teszi a transzkripciós faktorok további szabályozását a sejtmagban való jelenlétük időtartama alapján, amelyet szerkezetük reverzibilis változásai és más fehérjék kötődése szabályoz. [35] A környezeti ingerek vagy endokrin jelek [36] a szabályozó fehérjék [37] módosulását idézhetik elő, ami intracelluláris jelek kaszkádjait váltja ki, [38] ami a génexpresszió szabályozását eredményezi.

Újabban nyilvánvalóvá vált, hogy a nem DNS-szekvencia-specifikus hatások jelentős mértékben befolyásolják a transzkripciót. Ezeket a hatásokat epigenetikainak nevezik, és magukban foglalják a DNS magasabb rendű szerkezetét, a nem szekvenciaspecifikus DNS-kötő fehérjéket és a DNS kémiai módosítását. Általában az epigenetikai hatások megváltoztatják a DNS fehérjékhez való hozzáférését, és így módosítják a transzkripciót.

Az eukariótákban a kromatin szerkezete, amelyet a hisztonkód szabályoz, szabályozza a DNS-hez való hozzáférést, ami jelentős hatással van a gének expressziójára az euchromatin és heterokromatin területeken.

Enhancerek, transzkripciós faktorok, mediátor komplex és DNS hurkok az emlős transzkripcióban Szerkesztés

Az emlősökben a génexpressziót számos cisz-szabályozó elem szabályozza, beleértve a magpromotereket és a promoter-proximális elemeket, amelyek a gének transzkripciós kezdőhelyei közelében, a DNS-től felfelé (a szenzorszál 5' régiója felé) helyezkednek el. Más fontos cisz-szabályozó modulok olyan DNS-régiókban találhatók, amelyek távol vannak a transzkripció kezdőhelyétől. Ezek közé tartoznak az erősítők, hangtompítók, szigetelők és kötőelemek. [39] Az elemek ezen konstellációjában az enhanszereknek és a hozzájuk kapcsolódó transzkripciós faktoroknak van vezető szerepük a génexpresszió szabályozásában. [40]

Az enhancerek a genom azon régiói, amelyek fő génszabályozó elemek. Az enhancerek szabályozzák a sejttípus-specifikus génexpressziós programokat, leggyakrabban úgy, hogy nagy távolságokat hurkolnak át, hogy fizikai közelségbe kerüljenek célgénjeik promótereivel. [41] Több enhanszer, amelyek mindegyike gyakran tíz- vagy százezer nukleotid távolságra van a célgénjétől, hurkot kapcsol a célgén-promoterekhez, és egymással koordinálva szabályozza közös célgénjük expresszióját. [41]

A bal oldali sematikus ábra egy enhanszert mutat be, amely körbe-körbe hurkol, hogy közvetlen fizikai közelségbe kerüljön a célgén promóterével. A hurkot egy összekötő fehérje dimerje (pl. CTCF vagy YY1 dimer) stabilizálja, a dimer egyik tagja a kötőmotívumához van rögzítve az enhanszeren, a másik tagja pedig a promóteren lévő kötőmotívumához van rögzítve (ezt a piros cikkcakk az illusztráción). [42] Számos sejtfunkció-specifikus transzkripciós faktor (egy emberi sejtben körülbelül 1600 transzkripciós faktor van [43]) általában egy enhanszer specifikus motívumához kötődik [44] és ezeknek az enhanszerhez kötött transzkripciós faktoroknak egy kis kombinációjához, ha közelítjük őket. egy DNS hurok által egy promoterhez irányítják a célgén transzkripciójának szintjét. A mediátor (egy komplex, amely általában körülbelül 26 fehérjéből áll egy kölcsönható szerkezetben) az enhanszer DNS-hez kötött transzkripciós faktorok szabályozó jeleit közvetlenül a promoterhez kötött RNS polimeráz II (pol II) enzimhez továbbítja. [45]

Az enhancerek, ha aktívak, általában a DNS mindkét száláról íródnak át, az RNS-polimerázok két különböző irányban hatnak, és két eRNS-t termelnek, amint az az ábrán látható. [46] Egy inaktív enhanszert inaktív transzkripciós faktor köthet. A transzkripciós faktor foszforilációja aktiválhatja, és az aktivált transzkripciós faktor aktiválhatja az enhanszert, amelyhez kötődik (lásd az ábrán a kis vörös csillagot, amely az enhanszerhez kötött transzkripciós faktor foszforilációját jelzi). [47] Egy aktivált enhanszer megkezdi RNS-ének transzkripcióját, mielőtt aktiválná a hírvivő RNS transzkripcióját a célgénjéből. [48]

DNS-metiláció és demetiláció a transzkripciós szabályozásban Szerk

A DNS-metiláció egy széles körben elterjedt mechanizmus a génexpresszió epigenetikai befolyásolására, és baktériumokban és eukariótákban látható, és szerepet játszik az öröklődő transzkripció elnémításában és a transzkripció szabályozásában. A metilezés leggyakrabban citozinon történik (lásd az ábrát). A citozin metilezése elsősorban a dinukleotid szekvenciákban történik, ahol a citozint egy guanin, egy CpG hely követi. A CpG helyek száma az emberi genomban körülbelül 28 millió. [49] A sejt típusától függően a CpG helyek körülbelül 70%-a metilált citozint tartalmaz. [50]

A citozin metilezése a DNS-ben nagy szerepet játszik a génexpresszió szabályozásában. A CpG-k metilezése egy gén promóterrégiójában általában elnyomja a géntranszkripciót [51], míg a CpG-k metilezése egy gén testében fokozza az expressziót. [52] A TET enzimek központi szerepet játszanak a metilezett citozinok demetilációjában. A CpG-k demetilációja egy génpromoterben a TET enzimaktivitás révén növeli a gén transzkripcióját. [53]

Transzkripciós szabályozás a tanulásban és a memóriában Szerk

Patkányban a kontextuális félelem kondicionálása (CFC) fájdalmas tanulási tapasztalat. A CFC egyetlen epizódja is életre szóló félelmetes emléket eredményezhet. [54] A CFC egy epizódja után a citozin metilációja megváltozik a patkányok hippocampus neuron DNS-ében található összes gén mintegy 9,17%-ának promoterrégiójában. [55] A hippocampus az a hely, ahol kezdetben az új emlékeket tárolják. A CFC után körülbelül 500 génnek megnövekedett a transzkripciója (gyakran a CpG helyek demetilációja miatt egy promoter régióban), és körülbelül 1000 génnél csökkent a transzkripció (gyakran az újonnan képződött 5-metilcitozin miatt a CpG helyeken egy promoter régióban). Úgy tűnik, hogy a neuronokon belüli indukált és elnyomott gének mintázata molekuláris alapot biztosít a patkányagy hippokampuszában a tréning esemény első átmeneti emlékének kialakításához. [55]

Különösen az agyból származó neurotróf faktor gén (BDNF) „tanulási génként” ismert. [56] A CFC-t követően felszabályozás következett be BDNF génexpresszió, ami a gén bizonyos belső promótereinek csökkent CpG-metilációjához kapcsolódik, és ez korrelált a tanulással. [56]

Transzkripciós szabályozás a rákban Szerk

A génpromoterek többsége CpG szigetet tartalmaz számos CpG hellyel. [57] Amikor egy gén számos promoter CpG helye metilálódik, a gén elnémul. [58] A vastag- és végbélrákban jellemzően 3-6 vezető mutáció és 33-66 stoppos vagy utas mutációja van. [59] A transzkripciós elnémítás azonban fontosabb lehet a mutációnál a rák progressziójában. Például vastagbélrákban körülbelül 600-800 gént transzkripciósan elnémít a CpG-sziget metilációja (lásd a transzkripció szabályozását rákban). A rák transzkripciós repressziója más epigenetikai mechanizmusok, például a mikroRNS-ek megváltozott expressziója révén is előfordulhat. [60] Mellrákban a BRCA1 transzkripciós repressziója gyakrabban fordulhat elő túlzottan expresszált mikroRNS-182 miatt, mint a BRCA1 promoter hipermetilációja miatt (lásd a BRCA1 alacsony expresszióját mell- és petefészekrákban).

Transzkripció utáni szabályozás Szerk

Az eukariótákban, ahol az RNS-exportra van szükség, mielőtt a transzláció lehetséges, a sejtmagexportról úgy gondolják, hogy további szabályozást biztosít a génexpresszió felett. A sejtmagba be- és kiszállítás a nukleáris pórusokon keresztül történik, és a szállítást az importin és exportin fehérjék széles köre szabályozza.

Egy fehérjét kódoló gén expressziója csak akkor lehetséges, ha a kódot hordozó hírvivő RNS elég sokáig fennmarad ahhoz, hogy lefordítható legyen. Egy tipikus sejtben egy RNS-molekula csak akkor stabil, ha kifejezetten védett a lebomlástól. Az RNS lebontásának különös jelentősége van az expresszió szabályozásában az eukarióta sejtekben, ahol az mRNS-nek jelentős távolságokat kell megtennie, mielőtt transzlációt végezne. Az eukariótákban az RNS-t bizonyos poszttranszkripciós módosítások stabilizálják, különösen az 5′-sapka és a poliadenilált farok.

Az mRNS szándékos lebontását nem csak védekezési mechanizmusként használják az idegen RNS-től (általában vírusoktól), hanem az mRNS útjaként is. destabilizáció. Ha egy mRNS-molekula komplementer szekvenciával rendelkezik egy kis interferáló RNS-sel, akkor az RNS-interferencia útvonalon keresztül megsemmisül.

Három elsődleges nem lefordított régió és mikroRNS Szerkesztés

A hírvivő RNS-ek (mRNS-ek) három elsődleges, nem lefordított régiója (3′UTR) gyakran tartalmaz olyan szabályozó szekvenciákat, amelyek a transzkripciót követően befolyásolják a génexpressziót. Az ilyen 3'-UTR-ek gyakran tartalmaznak mind a mikroRNS-ek (miRNS-ek), mind a szabályozó fehérjék kötőhelyeit. A 3'-UTR-on belüli specifikus helyekhez kötve a miRNS-ek csökkenthetik a különböző mRNS-ek génexpresszióját azáltal, hogy gátolják a transzlációt, vagy közvetlenül okozzák a transzkriptum lebomlását. A 3'-UTR tartalmazhat olyan hangtompító régiókat is, amelyek olyan represszor fehérjéket kötnek, amelyek gátolják az mRNS expresszióját.

A 3′-UTR gyakran tartalmaz mikroRNS-válaszelemeket (MRE). Az MRE-k olyan szekvenciák, amelyekhez miRNS-ek kötődnek. Ezek a 3′-UTR-en belül elterjedt motívumok. A 3′-UTR-eken belüli összes szabályozó motívum közül (például beleértve a hangtompító régiókat is) az MRE-k a motívumok körülbelül felét teszik ki.

2014-ben a miRBase webhely, [61] a miRNS-szekvenciák és annotációk archívuma, 28 645 bejegyzést sorolt ​​fel 233 biológiai fajról. Ezek közül 1881 miRNS volt annotált humán miRNS lókuszban. Az előrejelzések szerint a miRNS-ek átlagosan körülbelül négyszáz cél-mRNS-t tartalmaznak (több száz gén expresszióját befolyásolva). [62] Friedman et al. [62] becslése szerint >45 000 miRNS célhely a humán mRNS 3′UTR-en belül a háttérszint felett konzervált, és a humán fehérjét kódoló gének >60%-a szelektív nyomás alatt állt, hogy fenntartsák a miRNS-ekkel való párosítást.

A közvetlen kísérletek azt mutatják, hogy egyetlen miRNS csökkentheti több száz egyedi mRNS stabilitását. [63] Más kísérletek azt mutatják, hogy egyetlen miRNS elnyomhatja több száz fehérje termelését, de ez a represszió gyakran viszonylag enyhe (kevesebb mint kétszeres). [64] [65]

Úgy tűnik, hogy a génexpresszió miRNS-zavarának hatásai fontosak a rákban. [66] Például gasztrointesztinális rákos megbetegedések esetén kilenc miRNS-t azonosítottak epigenetikailag megváltozottnak és hatékonynak a DNS-javító enzimek leszabályozásában. [67]

A génexpresszió miRNS-zavarának hatásai fontosnak tűnnek neuropszichiátriai betegségekben is, mint például skizofrénia, bipoláris zavar, major depresszió, Parkinson-kór, Alzheimer-kór és autizmus spektrum zavarok. [68] [69]

Fordítási szabályzat Szerk

A transzláció közvetlen szabályozása kevésbé elterjedt, mint a transzkripció vagy az mRNS stabilitásának szabályozása, de alkalmanként alkalmazzák. A fehérjetranszláció gátlása a toxinok és az antibiotikumok fő célpontja, ezért képesek elpusztítani a sejtet, ha felülírják a normál génexpresszió-szabályozást. A fehérjeszintézis-gátlók közé tartozik a neomicin antibiotikum és a ricin toxin.

Fordítás utáni módosítások Szerk

A poszttranszlációs módosítások (PTM) a fehérjék kovalens módosításai. Az RNS splicinghez hasonlóan elősegítik a proteom jelentős diverzifikálását. Ezeket a módosulásokat általában enzimek katalizálják. Ezenkívül az olyan folyamatokat, mint az aminosav-oldallánc-maradékokhoz való kovalens addíció, gyakran megfordíthatják más enzimek. Néhányuk azonban, mint például a fehérje gerincének proteolitikus hasítása, visszafordíthatatlan. [70]

A PTM-ek számos fontos szerepet játszanak a sejtben. [71] Például a foszforiláció elsősorban a fehérjék aktiválásában és deaktiválásában, valamint a jelátviteli útvonalakban vesz részt. [72] A PTM-ek részt vesznek a transzkripció szabályozásában: az acetilezés és metiláció fontos funkciója a hiszton farokmódosítása, amely megváltoztatja a DNS hozzáférhetőségét a transzkripcióhoz. [70] Az immunrendszerben is megfigyelhetők, ahol a glikoziláció kulcsszerepet játszik. [73] A PTM egyik típusa egy másik típusú PTM-et indíthat el, amint az látható abból, hogy az ubiquitináció hogyan jelöli meg a fehérjéket a proteolízis révén történő lebontáshoz. [70] A proteolízis a fehérjék lebontásán kívül fontos azok aktiválásában és deaktiválásában, valamint a biológiai folyamatok szabályozásában, mint például a DNS-transzkripció és a sejthalál. [74]

A génexpresszió mérése számos élettudomány fontos részét képezi, hiszen az a képesség, hogy számszerűsítsük, hogy egy adott gén milyen szinten fejeződik ki egy sejtben, szövetben vagy szervezetben, sok értékes információval szolgálhat. Például a génexpresszió mérése:

  • A sejt vírusfertőzésének azonosítása (vírusfehérje-expresszió).
  • Határozza meg az egyén rákérzékenységét (onkogén expressziója).
  • Állapítsa meg, hogy egy baktérium rezisztens-e a penicillinre (béta-laktamáz expresszió).

Hasonlóképpen, a fehérjeexpresszió helyének elemzése hatékony eszköz, és ez szervezeti vagy sejtszinten is elvégezhető. A lokalizáció vizsgálata különösen fontos a többsejtű élőlények fejlődésének tanulmányozása szempontjából, valamint a fehérje működésének indikátoraként egy sejtben. Ideális esetben az expresszió mérése a végső géntermék kimutatásával történik (sok gén esetében ez a fehérje), azonban gyakran könnyebb kimutatni az egyik prekurzort, jellemzően az mRNS-t, és ezekből a mérésekből következtetni a génexpressziós szintekre.

MRNS mennyiségi meghatározása Szerk

Az mRNS szintje kvantitatívan mérhető Northern blottal, amely méret- és szekvencia információt szolgáltat az mRNS molekulákról. Az RNS-mintát agarózgélen választjuk el, és egy radioaktívan jelölt RNS-próbához hibridizáljuk, amely komplementer a célszekvenciával. A radioaktívan jelölt RNS-t ezután autoradiográffal detektáljuk. Mivel a radioaktív reagensek használata időigényessé és potenciálisan veszélyessé teszi az eljárást, alternatív jelölési és kimutatási módszereket, például digoxigenin és biotin kémiákat fejlesztettek ki. A Northern blottolás észlelt hátrányai az, hogy nagy mennyiségű RNS-re van szükség, és előfordulhat, hogy a mennyiségi meghatározás nem teljesen pontos, mivel a gél képén a sáv erejét kell mérni. Másrészt a Northern blotból származó további mRNS méretinformáció lehetővé teszi a váltakozva összeillesztett transzkriptumok megkülönböztetését.

Egy másik módszer az mRNS bőség mérésére az RT-qPCR. Ennél a technikánál a reverz transzkripciót kvantitatív PCR követi. A reverz transzkripció először egy DNS-templátot hoz létre az mRNS-ből, ezt az egyszálú templátot cDNS-nek nevezik. A cDNS-templátot ezután a kvantitatív lépésben amplifikálják, amelynek során a jelölt hibridizációs próbák vagy az interkaláló festékek által kibocsátott fluoreszcencia a DNS-amplifikációs folyamat előrehaladtával változik. A gondosan megszerkesztett standard görbével a qPCR képes abszolút mérést adni az eredeti mRNS kópiáinak számáról, jellemzően a homogenizált szövet nanoliterére eső kópia egységekben vagy sejtenkénti másolatokban. A qPCR nagyon érzékeny (egyetlen mRNS molekula kimutatása elméletileg lehetséges), de a használt riporter típusától függően költséges lehet. A fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próbák drágábbak, mint a nem specifikus interkaláló fluoreszcens festékek.

Az expressziós profilalkotáshoz vagy egy mintán belüli sok gén nagy áteresztőképességű elemzéséhez, kis sűrűségű tömbök esetén kvantitatív PCR-t lehet végrehajtani több száz génre egyidejűleg. Egy másik megközelítés a hibridizációs microarray. Egyetlen tömb vagy "chip" tartalmazhat próbákat, amelyek egy vagy több szervezet genomjában minden ismert gén transzkriptumszintjét határozzák meg. Alternatív megoldásként használhatók a "címkén alapuló" technológiák, mint például a génexpresszió soros elemzése (SAGE) és az RNA-Seq, amelyek relatív mérést nyújthatnak a különböző mRNS-ek sejtkoncentrációjáról. A címkén alapuló módszerek előnye a „nyílt architektúra”, amely lehetővé teszi bármely ismert vagy ismeretlen szekvenciájú transzkriptum pontos mérését. A következő generációs szekvenálás (NGS), például az RNA-Seq egy másik megközelítés, amely hatalmas mennyiségű szekvenciaadatot állít elő, amely egy referenciagenomhoz illeszthető. Bár az NGS viszonylag időigényes, drága és erőforrás-igényes, képes azonosítani az egynukleotidos polimorfizmusokat, splice-variánsokat és új géneket, és felhasználható olyan szervezetek expressziójának profilálására is, amelyekről kevés vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre szekvencia-információ. .

RNS-profilok a Wikipedia Szerkesztésben

Az ehhez hasonló profilok a Wikipédiában felsorolt ​​szinte összes fehérjéhez megtalálhatók. Ezeket olyan szervezetek állítják elő, mint a Novartis Kutatási Alapítvány Genomikai Intézete és az Európai Bioinformatikai Intézet. További információkat találhat az adatbázisukban való kereséssel (az itt látható GLUT4 transzporterre lásd az idézetet). [75] Ezek a profilok egy bizonyos fehérje DNS-expressziójának (és ezáltal a termelt RNS-nek) szintjét jelzik egy bizonyos szövetben, és ennek megfelelően színkódolva vannak az egyes Wikipédia-oldalak jobb oldalán található Protein Box-ban található képeken.

Fehérje mennyiségi meghatározása Szerkesztés

A fehérjéket kódoló gének expressziós szintjét számos módszerrel közvetlenül meg lehet határozni, néhány egyértelmű analógia mellett az mRNS mennyiségi meghatározására szolgáló technikákkal.

Az egyik leggyakrabban használt módszer a Western blot elvégzése a kérdéses fehérje ellen. [76] Ez az azonosságon túl a fehérje méretéről is ad információt. A mintát (gyakran celluláris lizátumot) poliakrilamid gélen választják el, egy membránra visszük, majd a kérdéses fehérje elleni antitesttel vizsgálják. Az antitest vagy fluoroforhoz vagy torma-peroxidázhoz konjugálható leképezés és/vagy mennyiségi meghatározás céljából. Ennek a vizsgálatnak a gél alapú jellege miatt a mennyiségi meghatározás kevésbé pontos, de megvan az az előnye, hogy képes azonosítani a fehérje későbbi módosításait, például a proteolízist vagy az ubiquitinációt a méretváltozásokból.

MRNS-protein korreláció Szerk

A fehérje és az mRNS mennyiségi meghatározása lehetővé teszi a két szint korrelációját. Az a kérdés, hogy mennyire korrelálnak a fehérjeszintek a megfelelő transzkriptumszintekkel, erősen vitatott, és több tényezőtől is függ. A génexpresszió egyes lépéseinek szabályozása befolyásolhatja a korrelációt, amint azt a transzláció [19] vagy a fehérje stabilitásának szabályozása mutatja. [77] A poszttranszlációs faktorok, mint például a fehérjetranszport erősen poláris sejtekben, [78] a mért mRNS-fehérje korrelációt is befolyásolhatják.

Lokalizáció Szerk

Az expresszió elemzése nem korlátozódik a kvantifikációra, a lokalizáció is meghatározható. Az mRNS kimutatható egy megfelelően jelölt komplementer mRNS-szállal, a fehérje pedig jelölt antitestekkel. A szondázott mintát ezután mikroszkóppal megfigyelik, hogy azonosítsák, hol található az mRNS vagy fehérje.

Ha a gént egy új, zöld fluoreszcens fehérje (vagy hasonló) markerrel fuzionált változatra cseréljük, az expresszió közvetlenül meghatározható élő sejtekben. Ez fluoreszcens mikroszkóp segítségével történő képalkotással történik. Nagyon nehéz egy GFP-vel fuzionált fehérjét a natív helyére klónozni a genomban az expressziós szintek befolyásolása nélkül, így ez a módszer gyakran nem használható endogén génexpresszió mérésére. Széles körben alkalmazzák azonban a sejtbe mesterségesen, például expressziós vektoron keresztül bevitt gén expressziójának mérésére. Fontos megjegyezni, hogy egy célfehérje fluoreszcens riporterhez fuzionálásával a fehérje viselkedése, beleértve a sejtes lokalizációját és expressziós szintjét, jelentősen megváltoztatható.

Az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat úgy működik, hogy mikrotiterlemezre rögzített antitesteket használ, hogy befogja a kérdéses fehérjéket a lyukba adott mintákból. Egy enzimhez vagy fluoroforhoz konjugált detektáló antitest használatával a megkötött fehérje mennyisége pontosan mérhető fluorometriás vagy kolorimetriás kimutatással. A detektálási folyamat nagyon hasonló a Western blothoz, de a géllépések elkerülésével pontosabb mennyiségi meghatározás érhető el.

Az expressziós rendszer egy olyan rendszer, amelyet kifejezetten egy választott géntermék előállítására terveztek. Ez általában egy fehérje, de lehet RNS is, például tRNS vagy ribozim. Az expressziós rendszer egy génből áll, amelyet általában a DNS kódol, és a molekuláris gépezetből, amely a DNS mRNS-vé történő átírásához és az mRNS fehérjévé történő fordításához szükséges a mellékelt reagensek segítségével. A legtágabb értelemben ez minden élő sejtet magában foglal, de a kifejezést általában az expresszióra mint laboratóriumi eszközre használják. Egy kifejezési rendszer ezért gyakran valamilyen módon mesterséges. Az expressziós rendszerek azonban alapvetően természetes folyamatok. A vírusok kiváló példái annak, amikor a gazdasejtet a vírusfehérjék és a genom expressziós rendszereként használják fel.

Indukálható kifejezés Szerk

A természetben Szerk

Ezeken a biológiai eszközökön kívül a DNS bizonyos természetesen megfigyelt konfigurációit (gének, promóterek, enhanszerek, represszorok) és magát a kapcsolódó gépezetet expressziós rendszernek nevezik. Ezt a kifejezést általában abban az esetben használják, ha egy gén vagy génkészlet jól meghatározott körülmények között van bekapcsolva, például az egyszerű represszorkapcsoló expressziós rendszer a lambda fágban és a lac operátor rendszer baktériumokban. Számos természetes expressziós rendszert közvetlenül használnak vagy módosítanak és alkalmaznak mesterséges expressziós rendszerekhez, például a Tet-on és Tet-off expressziós rendszerekhez.

A géneket néha csomópontoknak tekintik egy hálózatban, ahol a bemenetek fehérjék, például a transzkripciós faktorok, a kimenetek pedig a génexpresszió szintjét jelentik. Maga a csomópont egy funkciót lát el, és e funkciók működését úgy értelmezték, hogy egyfajta információfeldolgozást végeznek a cellákon belül, és meghatározzák a cella viselkedését.

A génhálózatokat explicit oksági modell megfogalmazása nélkül is fel lehet építeni. Ez gyakran előfordul, ha hálózatokat állít össze nagy kifejezési adatkészletekből. [79] Az expresszió kovariációját és korrelációját esetek és mérések nagy mintájára (gyakran transzkriptom vagy proteom adatok) számítják ki. A variáció forrása lehet kísérleti vagy természetes (megfigyelési). Számos módja van a génexpressziós hálózatok felépítésének, de az egyik általános megközelítés az expresszió összes páronkénti korrelációjának mátrixának kiszámítása feltételek, időpontok vagy egyedek között, és a mátrixot (a küszöbérték bizonyos határértéken történő küszöbérték megadása után) konvertálják egy grafikus ábrázolás, amelyben a csomópontok géneket, transzkriptumokat vagy fehérjéket képviselnek, az ezeket a csomópontokat összekötő élek pedig az asszociáció erősségét (lásd [1]). [80]

A következő kísérleti technikákat használjuk a génexpresszió mérésére, és nagyjából időrendben vannak felsorolva, kezdve a régebbi, bevált technológiákkal. Multiplexitásuk alapján két csoportra oszthatók.


Vita

Lehetővé teszi az ismeretlen gének finom funkcionális kutatását és egy stabil és hatékony létrehozását B. mori selyemmirigy bioreaktor, a pozícióhatások és az inszerciós mutagenezis által okozott hátrányai piggyBac-a közvetített véletlenszerű integrációt le kell győzni. Ezért különböző genomiális manipulációs technikák és az optimalizált fibroin H-lánc expressziós rendszer kombinációját alkalmaztuk, hogy általános és hatékony stratégiát dolgozzunk ki egy stabil, helyettesíthető és rendkívül hatékony transzgén expressziós rendszer létrehozására a selyemhernyóban. Ennek a stratégiának a kidolgozásához először a selyemhernyók genomjába illesztettünk egy exogén célgén expressziós kazettát, amely hatékonyan és szelektíven fejezi ki a célfehérjét a selyemhernyó selyemmirigyeiben, a kompozit segítségével. piggyBac-eredetű PB-TP vektor, amely véletlenszerűen integrálódott a kezdeti csíravonal transzformáció során. A PB-TP vektor szerkezetét fentebb leírtuk. Figyelemre méltó, hogy ez az összetett vektor, két teljes hosszúságú vad típusú piggyBac karok R1 (1050 bp) és L1 (678 bp), kettő pedig lerövidült piggyBac Az L2 (309 bp) és az R2 (238 bp) karok négy potenciális transzpozont kódolnak (S1 kiegészítő ábra). Közölték, hogy a rövid piggyBac kar konstrukciók használhatók a mobilizációs hatékonyság javítására piggyBac genomjában D. melanogaster 49 és B. mori 50 . Ezért az L2-t és az R2-t azért fejlesztették ki, hogy javítsák az R1–L2 és R2–L1 remobilizáció hatékonyságát B. mori in vivo, ezáltal javítva az R1–L2 és R2–L1 deléciós hatékonyságát a kezdeti kromoszómális inszerciós lókuszból. Számos korábbi tanulmány is kimutatta, hogy nemcsak a TIR-ek, hanem a határoló szekvenciák is piggyBac, különösen a TTAA helyek szükségesek a sikeres átültetéshez 51 . Ezért a TTAA helyeket az L2 és R2 szekvenciák 3' végén építettük meg az összetett vektorban (az S1 kiegészítő táblázat primer szekvenciáiban látható). Más exogén gének precíz integrálása érdekében ugyanazon a genomi lokuszon, mint a célgén a phiC31 által közvetített RMCE-vel, két attP A célgén expressziós kazettát szegélyező helyeket ugyanabban az orientációban vezettük be.

Ebben a vizsgálatban négy különböző transzgenikus törzset, a TS1-RgG1-TS1-RgG4-et hoztunk létre, az R1-L1 transzpozon véletlenszerű beépítésével a selyemhernyó-genomba, és a különböző TS1-RgG törzsek gubói 0,9%-os tiszta EGFP-tartalmat mutattak. 16 tömeg%-ra. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a különböző kromoszómális lókuszokba inszertált transzgén nagymértékben befolyásolja az exogén fehérje expresszióját a selyemhernyóban. Tudomásunk szerint a TS1-RgG2 eddig a leghatékonyabb transzgénikus selyemhernyó törzs, amely exogén fehérjét termel a selyemmirigyben 18,20,52,53,54,55 . A PBase génexpressziós kazettát és a TS2-RgG2 összes markergénjét tartalmazó transzpozonszekvenciák ezt követő eliminációja a transzpozáz hősokk által kiváltott expressziójával fejeződött be. in vivo, TS3-g2-t generál, amely csak a attP-szegélyezett optimalizált fibroin H-lánc expressziós kazetta a genomjában. Ez a módszer nemcsak a célgén remobilizációját akadályozza meg, hanem kiküszöböli a szelektálható markergének káros hatásait is a transzgenikus rovar bármely jövőbeni alkalmazása során, amelyek befolyásolhatják a célgének expresszióját, a transzgenikus egyedek növekedését és fejlődését. , horizontális géntranszfer, vagy a transzgénikus rovarokkal kapcsolatos egyéb potenciális ökológiai biztonsági problémák 21 . A szekvenálási eredmények azt mutatták, hogy a kimetszéshelyi TTAA elemeken, ill. attP helyek a TS3-g2 egyedek genomjában. A további eredmények megerősítették az integráció genetikai stabilitását és kifejeződését EGFP gén a TS3-g2 utódokban. Egy jövőbeli tanulmányban a különböző érdeklődésre számot tartó géneket pontosan a TS3-g2 selyemhernyó ugyanarra a genomi lokuszára helyezik el egy phiC31 által közvetített RMCE reakció segítségével. Ezzel a transzgenikus selyemhernyókban a különböző exogén fehérjék rendkívül hatékony, stabil expressziója érhető el, amelyet a fibroin H-lánc promoter közvetít. Mivel a phiC31-integráz által közvetített rekombináció a attP és attB helyek egyirányú, ez biztosítja a transzgének stabilitását az RMCE reakció után 56 . Az ebben a tanulmányban létrehozott TS3-g2 selyemhernyók segítségével rendkívül hatékony transzgénikus selyemhernyó-selyemmirigy bioreaktort lehet létrehozni exogén fehérjék előállítására. Fontos, hogy felhasználhatók a természetes gubóselymek javítására és új, nagy szakítószilárdságú, nagy tapadású és egyéb kiváló tulajdonságokkal rendelkező selyemszálak előállítására, szerkezetileg rokon fehérjék selyemmirigy-specifikus expressziójával (mint például a pók húzólánc protein 57, 58 ). Valójában más selyemmirigy-specifikus promóterek (mint pl FibL 59,60 , fhx 52 és Ser1 promóterek 61 ) vagy szövetspecifikus promoterek (például zsírtest-62, középbél-63 és hemocita-specifikus promoterek 64) szintén felhasználhatók stabil, cserélhető és rendkívül hatékony transzgén expressziós rendszerek létrehozására a selyemhernyóban ezzel az általános stratégiával ( 1.ábra). Emellett az FLP/FRT és Cre/loxP rendszereket sikeresen alkalmaztak RMCE reakciókhoz D. melanogaster 22,29,65 . Ezenkívül Schetelig és Handler nemrégiben leírt egy Cre-madiaated RMCE rendszert, amely rendkívül hatékony D. melanogaster és először egy nem-drozofillégyben a tephritid légy, Anastrepha suspensa 66 . A phiC31 által közvetített RMCE rendszerhez képest az FLP- és Cre-közvetített RMCE-nek van a fő előnye, amely lehetővé tette a transzgének több inszerciós/deléciós eseményét egyetlen lókuszban65,66. A jövőbeni munkák során az FLP- és Cre-közvetített RMCE-rendszereket a fent leírt különböző genomiális manipulációs technikákkal is kombinálni lehetne, és hatékony eszközként be lehetne vezetni a funkcionális genomiális összehasonlításokhoz és a legfejlettebb transzgenikus selyemhernyó-törzsek kifejlesztéséhez alkalmazott felhasználásra.

Ebben a vizsgálatban a PB-TP vektor és a pHA3PIG segítő plazmid keverékét injektáltuk G0 tojásokba, hogy TS1 egyedeket hozzunk létre kezdeti csíravonal-transzformációval. A transzgenikus egyedek a PB-TP vektor önmagában történő injektálásával is előállíthatók, segítő plazmid nélkül, mivel a Drosophila hsp70 A PB-TP vektorban lévő promoter rendkívül hatékony tranziens fehérje expressziót indukál számos különböző rovarfaj embriójában, beleértve D. melanogaster 10 , Anopheles Stephensi 40 és B. mori 67 . Négy különböző transzpozon szerkezeti kombinációját kódolja az összetett PB-TP vektor, de a kezdeti transzformáció során csak az R1-L1 konstrukció csíravonali transzformációja volt várható. Ezért egy selyemhernyó citoplazmatikus A3-promoter által vezérelt Pbase génexpressziós vektort, a pHA3PIG-t használták segítő plazmidként a PBase termeléséhez, amely növeli a kezdeti várható transzformáció hatékonyságát, ezáltal növelve a TS1-RgG egyedek termelődésének valószínűségét.

Itt is használtuk a hsp70 promótert indukálni PBase génexpressziót a TS2-RgG2 egyedekben in vivo HST-vel. A HST módszer egyszerűbb, mint a direkt injekciós módszer, és a szexuális hibridizációs módszer fő hátránya, hogy a PBase génszekvencia kerül be a hibrid utód genomjába, lehetővé téve a PBase perzisztens expresszióját, ami csökkentheti az R1–L2 és R2–L1 deléciós hatékonyságát. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a hsp70 promóter indukálja a legjobban a downstream gének expresszióját, ha a selyemhernyók folyamatos és ismétlődő HST-nek vannak kitéve 42°C-on fejlődési szakaszukban68,69. Az embrionális selyemhernyó egysejtű zigótából lárvává fejlődik, és a selyemhernyó negyedik lárvaállapota kritikus időszak a másodlagos spermatociták kialakulásában vagy az elsődleges petesejtek fejlődésében70. Ezért ebben a vizsgálatban 42 °C-on folyamatos és ismételt HST-t alkalmaztunk a transzgenikus selyemhernyók kezelésére az embrionális vagy a negyedik lárvaállapotú stádiumban. Az eredmények azt sugallják, hogy az embrionális vagy lárva állapotú HST befolyásolja a transzgenikus selyemhernyók normális növekedését, és a lárvaállapotú HST okozza a legmagasabb mortalitást (4. táblázat). Összehasonlítva a nem HST-kontroll csoportok egyedeinek utódaival, az R1–L2 és/vagy R2–L1 deléciós hatékonysága szignifikánsan magasabb volt a TS2-RgG2 egyedek utódaiban a HST csoportokban, különösen a fertőzött csoportok utódaiban. HST az embrionális stádiumban (5. táblázat). Az R2–L1 deléciós hatékonysága 80% volt a TS4-gG-2 egyedek utódaiban az embrionális stádiumban alkalmazott HST-vel (S3 kiegészítő táblázat és 5A ábra). Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy a transzgénikus selyemhernyók embrionális szakaszában a folyamatos és ismételt HST 42 °C-on a leghatékonyabb módja a transzpozonok eltávolításának utódaikból.

Azonban néhány G3 gG-pozitív fiasítást TS2-RgG2 egyedekből és G5 g-pozitív fiasításokat TS4-gG egyedekből is megfigyeltek a nem HST csoportokban, ami a PBase háttérexpressziójának tulajdonítható hsp70 promótert, bár ez a háttéraktivitás nagyon alacsony volt a transzgénikus selyemhernyókban in vivo (5. táblázat és S3 kiegészítő táblázat). Ezek az eredmények összhangban vannak egy korábbi tanulmány eredményeivel, amely az a Bombyx nukleáris receptor Ftz-F1 gén (BmFtz-F1) ellenőrzése alatt áll Drosophila hsp70 promoter transzgenikus selyemhernyókban 68 . Bár az alaptevékenység a hsp70 promóter alacsony volt 25°C-on, vizsgálatunk megerősíti, hogy a Drosophila hsp70 A promoter egy nagyon hatékony indukálható promoter az exogén gének expressziójának szabályozására transzgenikus selyemhernyókban.

Az elmúlt években sikeresen alkalmazták a genom-szerkesztési módszereket, mint például a cink ujj nukleázt (ZFN), a transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázt (TALEN) és a klaszteres, szabályosan interpersed short palindromikus ismétlődéseket (CRISPR), az RNS-vezérelt Cas9 nukleázt. és géneket hasítanak a selyemhernyóban 71,72,73. A TALEN által közvetített, egyszálú DNS-oligonukleotidok felhasználásával végzett génszerkesztéssel a selyemhernyó-genomba integrált DNS-fragmens hossza azonban nagyon korlátozott74, és az egyetlen hatékony. GFP kifejezés kazetta (A3-GFP-SV40T) a beütés még mindig nagyon korlátozott volt a selyemhernyóban a ZFN közvetítésével (csak 0,008%, 1/11770)75. A 7. ábra egy hatékony módszert mutat be korábban inszertált transzgének módosítására és a nagy DNS-fragmensek selyemhernyó-genomba történő integrálására, a piggyBac-alapú transzpozonmentes módszer, a phiC31 közvetített RMCE rendszer és az FLP/FRT rendszer. A phiC31/att Bebizonyosodott, hogy a rendszer lehetővé teszi akár 100 kb méretű DNS integrálását specifikus recipiens helyekre D. melanogaster 76, így ez a módszer használható lenne ezen genomszerkesztő rendszerek hátrányainak leküzdésére. Ezen túlmenően, az SSR rendszer és a fent leírt genom-szerkesztési módszerek kombinációjának meg kell küzdenie mind a transzpozonok véletlenszerű beépülésén, mind a nagy DNS-fragmensek genom-szerkesztő rendszerekkel történő integrációjával kapcsolatos problémákon.

Stratégia helyspecifikus génintegrációhoz phiC31-mediált RMCE-n keresztül, majd az ezt követő marker kivágás a céllókuszból az FLP/FRT rendszer.

A transzgénikus selyemhernyó-törzsek előállítása és szelekciója az 1-es célgén egyetlen példányát (Traget 1) tartalmazta transzpozon és markergén (Marker 1 és Marker 2) nélkül a genomjukban (Céllókuszok). piggyBac-eredetű plazmid és a Módszerek részben leírtak szerint, valamint az 1. ábrán látható módon. Rekombináció két attB/attP A donor vektorból és a phiC31 integráz (Int) által közvetített céllókuszból származó párok a taget gén 2 (Cél 2), a Marker 1 és egy indukálható promótert (IP) vezérlő FLP rekombináz expressziós kazetta (Ter) egyetlen másolatának integrációját eredményezték. terminációs szekvenciát jelzi) a selyemhernyó-genom céllókuszaiba. Az FLP rekombináz (FLP) ezt követő indukálható expressziója in vivo, amely képes katalizálni a kettő közötti rekombinációt FRT helyek és ennek eredményeként a Marker 1 és az FLP rekombináz expressziós kazetta kivágása a selyemhernyó-genom céllókuszaiból.

Összefoglalva, kidolgoztunk egy hatékony és általános stratégiát egy stabil, cserélhető és rendkívül hatékony transzgén expressziós rendszer előállítására B. mori. Stratégiánk hatékonyan kiküszöböli a remobilizációt piggyBac- közvetített integrált transzgének a selyemhernyóban. Más lepkék rovarokra is alkalmazható a biokontroll programokban kibocsátásra szánt transzgénikus törzsek ökológiai biztonságának javítására. Mivel a selyemhernyók kereskedelmileg fontos rovarok, és széles körben használják lepkék rovarok kísérleti modelljeként, a jelen tanulmányban megállapított transzgénikus törzsek nemcsak az exogén fehérjeexpresszió optimalizálására és a természetes gubóselymek tulajdonságainak javítására használhatók, hanem funkcionálisan is. genomikai kutatások, mint például a selyemhernyó-genom azonos helyein lévő különböző gének funkcióinak vizsgálata. Használata a piggyBac-alapú transzpozonmentes módszer kombinálva egy phiC31-közvetített RMCE rendszerrel B. mori vagy bármely más fajt eddig nem jelentettek. Egy jövőbeli tanulmányban stratégiánkat kombináljuk a fent leírt genom-szerkesztő rendszerekkel, hogy genomikus manipulációs technológiákat hozzunk létre a selyemhernyó és más lepkefajok esetében.


Az átültethető elemek és a genombiológia esszé

A transzpozonok mozgékony DNS-elemek, ugráló gének, amelyek képesek ugrálni a genomon belül vagy vízszintes átvitel útján. Mind a pro, mind az eukarióta genomokban megtalálhatók. Barbara McClintock először „vezérlő elemeknek” nevezte, majd később felváltották az áthelyezhető elemek (TE-k). Úttörő munkája a kukoricamag mozaik színmintáinak természetének és instabil öröklődésének megértésében vezetett az aktivátor (AC) és Disssociator (Ds) elemek felfedezéséhez a kukoricában. Ez megnyitotta az utat a genom dinamikus természetének és a génexpresszió szabályozási mechanizmusának megértéséhez (McClintock, 1950). Az emberi genomok több mint 45%-a transzpozonokból fejlődött ki (Lander et al., 2001), ami nagyon érdekessé teszi a tanulmányozásukat, és lehetőséget ad számunkra, hogy megértsük azokat az evolúciós erőket, amelyek az evolúció során genomunkat alakították. A transzponálandó TE-k nagy gyakorisága, körülbelül 103-105 elemenként generációnként, elegendő anyagot biztosít az evolúcióhoz ahhoz, hogy jelentős hatást gyakoroljon az új fajok kialakulására sorozatos mobilizáció vagy veszteség révén (Biémont és Vieira, 2006). Az evolúcióban betöltött szerepük mellett a TE-k ígéretes vektorokká válnak, amelyeket széles körben használnak a transzgenezisben és a génterápiás alkalmazásokban.

A TE-k szerkezete és átírása

Az eukarióta TE-ket transzponálási mechanizmusuk alapján nagyjából két fő osztályba sorolják. Az 1. osztályba tartozó elemek retrotranszpozonok, amelyek RNS-közvetített másolási és beillesztési módot alkalmaznak, a 2. osztályba tartozó elemek pedig a DNS-transzpozonok DNS-alapú kivágás és beillesztés transzpozíciót használnak (1A. ábra). A retrotranszpozonok az emberi genom körülbelül 42%-át teszik ki (Lander és mtsai, 2001), az RNS-t az elem által kódolt reverz transzkriptáz reverz transzkripciója írja le a DNS-be, amely integrálja őket egy új genomi helyre. Továbbra is fel vannak osztva Long Terminal Repeat (LTR) és nem LTR elemekre. Az emberi endogén retrovírusok (HERV-ek), amelyek szerkezetükben és mechanizmusukban hasonlítanak a reterovírusra, az LTR-be sorolhatók be, mivel egy nem működő burokgén megakadályozza a sejten kívüli átvitelüket. A humán genomban jelenlévő I. osztályú elemek többsége főként nem LTR hosszú interpersed elemek (LINE-k vagy L1-ek) (Lander et al., 2001). A transzaktivitás ritkán fordul elő a retro transzpozíciós gépezetük révén, amely nem autonóm, röviden átnyúló nukleáris elemeket (SINES) mozgósít, mint például az Alu és SVA elemek, amelyek feldolgozott pszeudogéneket képeznek (Boeke és Corces, 1989 Ostertag and Jr, 2001 Wei et al., 2001). . Bár a reterotranszpozonok túlnyomó többsége inaktív, egy átlagos emberi genom 80-100 aktív L1 elemből áll (Brouha et al., 2003).

1. ábra A transzponálható elemek típusai és a transzpozon mobilizáció mechanizmusa. A transzponálható elemek két nagy csoportba sorolhatók: (A) A DNS-transzpozon egyetlen gént kódol, a transzpozázt, amelyet két terminális fordított ismétlődés (IR) szegélyez. Az r transzpozáz enzim felismeri az IR-eket, kivágja az elemet és beilleszti egy új genomi lokuszba máshol. Az integrációs és kivágási helyeket a gazda-DNS javító enzim segítségével lezárják. (B) és (C) A reteroelemek (hosszú terminális ismétlődés (LTR) és nem LTR típus) egy RNS-intermedieren keresztül mozognak, és reverz transzkriptázt (RT), integarázt (IN) és endonukleázt (EN) kódolnak. Ennek a csoportnak mindegyike tartalmaz autonóm és nem autonóm elemeket. A nem autonóm elemek nem kódolják az átültetéshez szükséges funkcionális komponenseket, hanem az autonóm megfelelőjük tranzakciójától függenek mobilizálásukhoz. Utána módosítva (Levin és Moran, 2011)

A természetben a transzpozonok vagy teljes funkcionális másolatként léteznek, amely az összes komponenst (transzpozázt és felismerési szekvenciát) kódolja, vagy nem autonóm másolatként, a felismerési szekvenciával, amelyet transz-mobilizálni kell, és egy autonóm kópia kódolja. A transzpozon átírása a leglényegesebb és legalapvetőbb lépés az átültetés felé. Ezek vagy a saját promóterükre támaszkodnak, vagy egy szomszédos genomi promóterre. A retrovírus és az LTR elemek LTR-üket erős promóter/fokozó jelként használják a transzkripcióhoz, amely szükséges a következő generációba való sikeres szaporodáshoz az adott organizmusban (Boeke és Corces, 1989). A nem LTR elemekről, mint például az L1-ről kimutatták, hogy belső tulajdonságokkal rendelkeznek. promóter aktivitása az 5' nem transzlálható régiójukban (UTR) (Swergold, 1990).

A DNS-transzpozon egy transzpozázt kódoló génből áll, amelyet két terminális fordított ismétlődés (IR) határol. A transzpozáz enzim felismeri és megköti a két terminális fordított ismétlődést (IR), kivágja a DNS-t, és újra beilleszti egy új genomi helyre. Az eukarióta transzpozonok a transzpozíció mechanizmusa alapján három fő osztályba sorolhatók.

A kétszálú DNS klasszikus "cut-paste" transzpozonjai

Helitronok, amelyek a gördülő kör replikációs mechanizmusával transzponálódnak (Kapitonov és Jurka, 2001)

A Mavericks a saját DNS-polimerázát kódolja, és replikációs, másolás-beillesztési folyamaton keresztül transzponálja (Pritham et al., 2007).

Az emberi genomban jelenlévő DNS-transzpozonok a Tc-1/mariner szupercsaládba (azaz mariner, MER2-Tigger, Tc2), a hATsuper családba (azaz MER-1-charlie, Zaphod) és néhány PiggyBac-szerű elemhez tartoznak. A két nagy osztályt a transzpozíciós mechanizmus, a szekvencia hasonlóságok és a szerkezeti kapcsolatok alapján szupercsaládokra, majd családokra osztották. (Pace és Feschotte, 2007). A legtöbb DNS-transzpozon saját belső promóterének jelenléte jellemzi, vagy a szomszédos gének expressziójára támaszkodnak a transzpozáz átírásához. A saját promóterükkel transzponáló DNS-transzpozonok példái közé tartoznak a p-elemek legyekben (Kaufman és mtsai, 1989), az Ac és a mutátor elemek a növényekben (Fridlender és mtsai., 1998) (Raina és mtsai, 1993). A promóter tevékenysége nem mindig konzervált ugyanazon család tagjai között. A Tc-1/mariner esetében a növényekben lévő Pot2 elemek saját promoter aktivitással rendelkeznek mind szensz, mind antiszensz irányban (Kimura és Yamaguchi, 1998), valamint a C.elegansban a Tc3-nak (Moldt et al., 2007) és más tagoknak, mint pl. mivel a Tc1 transzpozonok a szomszédos genomi promóterek véletlenszerű átolvasási transzkripciójától függenek. (Sijen és Plasterk, 2003).

A gazdaszervezet szabályozza a TE-k expresszióját

A TE-ket gyakran „önző” vagy „parazita elemeknek” nevezik, mivel sikerük fordítottan arányos a gazdaszervezet alkalmasságával (Slotkin és Martienssen, 2007). A TE-k aktivitását gyakran ártalmasnak tekintik a gazdaszervezetre, mivel erősen mutagének, és beépülésük számos módon megváltoztathatja a szegélyező gének szabályozását és expresszióját. Bár a legtöbb transzpozon inaktív a mutációk miatt, érintetlenek maradhatnak, de csendben maradnak a gazda genomjában. A transzpozonok káros természetének minimalizálása érdekében a gazda genomja számos epigenetikai „védelmi” mechanizmust fejlesztett ki, amelyek egymástól függő útvonalak, például nem kódoló kis RNS-ek, DNS-metiláció és kromatin-módosítások a TE-k káros hatásainak védelme érdekében.

A TE-k piRNS és RNSi csendesítése

A kis interferáló RNS-ek (siRNS-ek) 21-30 nukleotidból álló RNS-molekulából álló rövid szakaszok, amelyeket a fehérjék feldaraboló családja hasít az RNS-interferenciának (RNAi) nevezett mechanizmussal. Az argonaut fehérjék az RNS-indukált csendesítő komplex (RISC) katalitikus komponensei. A Tc1 a C. elegans leggyakrabban előforduló transzpozoncsaládja, amelyet az RNSi elhallgat a csíravonalban (Sijen és Plasterk, 2003). Fontos, hogy az argonaute- és dicer-családba tartozó fehérjék mutációi számos eukarióta fajban a TE-k remobilizációját okozzák. Az emlősökben jelen lévő endogén siRNS-ekhez nagymértékben hozzájárul a TE-k aktivitása (Watanabe et al., 2006). Az emberi genom 17%-át kitevő L1 retrotranszpozonokat az RNSi elnémítja a promoterének szensz és antiszensz aktivitása miatt (Yang és Kazazian, 2006). A Piwi-vel kölcsönhatásba lépő RNS-ek (piRNS-ek) a hím csírasejt-fejlődés során expresszálódó, 30 nt hosszúságú kis RNS-ek új osztálya, amely a MIWI-vel, az Argonaute fehérjecsalád spermatogenezis-specifikus PIWI alcsaládjával, biogenezise és/vagy stabilitása miatt társul (Grivna). et al., 2006). A PiRNS-ek csoportokba rendeződnek egerekben és emberekben, ami a csírasejtfejlődésben közös funkcióra utal (Aravin et al., 2007). A Drosophila piwi génről kimutatták, hogy nagyon fontos a csíravonali őssejt (GSC) számára, amely erősen konzervált C. elegansban és emberben. Ezenkívül a cigány, P és amp I elemek mind elnémulnak a Drosophila csíravonalban, ahol a Piwi argonauta fehérjék aktívan expresszálódnak (Cox és mtsai, 1998) (Rehwinkel és mtsai, 2006). A TE-k szerkezeti jellemzői segíthetnek megkülönböztetni átirataikat a gazdagéntől a piRNS és RNSi útvonalon történő specifikus célzás érdekében.

1. ábra Kis RNS (sRNS) által közvetített géncsendesítési útvonalak. A dsRNS triggereket (amelyeket a hajtű képvisel), amelyek egy DNS-transzpozon fordított terminális ismétlődéseiből származnak, a Dicer fehérjék családja dolgozza fel és hasítja 21-24 nukleotidból álló (nt) siRNS-ekké. Ezek az siRNS-ek irányítják az Argonaute fehérjéket a komplementer hírvivő RNS-ekhez (mRNS-ekhez), és közvetítik ezek lebomlását vagy transzlációs represszióját. A csíravonal-specifikus, Piwi-kölcsönhatásba lépő RNS-ek feldolgozása hosszú egyszálú RNS-ből, gyakran transzpozonok antiszensz transzkriptumaiból történik. Az érett piRNS PIWI vagy padlizsán (AUB) fehérjék általi megkötése lehetővé teszi, hogy a TE mRNS komplementer szekvenciáihoz irányítsák. Az mRNS endonukleolitikus hasítása, a kis RNS 5′-es végétől 10 nt-re és a 3′-es hasítás/feldolgozás egy másodlagos szenzorszálú transzpozon piRNS-t szabadít fel, amely az Argonaute 3 (AGO3) fehérjéhez kapcsolódik. Ennek a komplexnek az eredeti prekurzor piRNS komplementer szekvenciáihoz való kötődése, majd az endonukleolitikus hasítás, egy antiszensz piRNS-t hoz létre, amely transzkripciós és poszttranszkripciós szinten TE mRNS-hez irányítható. Utána módosítva (Levin és Moran, 2011)

DNS metiláció és kromatin módosítások

A DNS-metiláció fontos epigenetikai markerként működik, amely kulcsfontosságú szerepet játszik a génexpresszió szabályozásában és a fejlődés során. Azok a DNS-metilációs minták, amelyek a csírasejtekben a gametogenezis során beállnak, nagyrészt törlődnek az embriogenezis során, és a beültetés után visszaállnak (Gaudet et al., 2004). A DNS-ben található citozin-maradékok növényekben és állatokban egyaránt metilezhetők. Ezeket általában a DNS-metiltranszferáz enzimek családja hajtja végre. Egérben a retrotranszpozon intraciszternális A-típusú részecske (IAP) metilációja elnyomja expresszióját az embriogenezisben. De a DNMT1, a DNS-metiláció fenntartásáért felelős DNS-metiltranszferáz inaktiválása az IAP-elemek megemelkedett szintjéhez vezet (Walsh et al., 1998).

1. ábra Az átültetés fejlődési kiváltó tényezői. A csíravonal transzponálható elem (TE) integrációs eseményei az ivarsejteket termelő sejtekben történő TE mobilitásból vagy a korai fejlődés során a megtermékenyítés utáni TE mobilitásból származhatnak. Az embrionális TE-mobilitás azokban a sejtekben, amelyek nem járulnak hozzá a csíravonalhoz vagy a mobilitáshoz a későbbi fejlődési szakaszokban, elvileg szomatikus TE-integrációs eseményekhez vezethet. Utána módosítva (Levin és Moran, 2011)

A DNS-metiláció fontos szerepet játszik a kromatin kondenzációjában és csomagolásában a hiszton amino- (N)-terminális végeinek módosításával, ami megváltoztatja a transzkripciós faktorokhoz való affinitását. A nukleoszómák TE dominált régiói feldúsulnak a H3 hiszton lizin 9-nél történő metilációjában (H3K9), ami a transzkripciós represszióhoz kapcsolódik (Martens et al., 2005). Arabidopsisban az RNS-irányított DNS-metilációt kétszálú RNS-sel indukálhatja az RNSi. A DICER-LIKE 3 (DCL3) olyan komponenseket toboroz, amelyek a DNS metilációját jelzik a katalitikus aktivitásától függetlenül, és nagyobb, 24-26 nukleotidból álló siRNS-t hoz létre, amely komplexet képez az Argonaute4-gyel (AGO4), és ez aszimmetrikus DNS-metilációval (Qi) elnémítja a TE-ket. et al., 2006). Az RNSi által közvetített transzkripciós géncsendesítés (TGS) emlősökben kevéssé ismert, de ismert, hogy a mesterségesen bevitt siRNS-ek képesek megkötni a Dnmt3a DNS-metiltranszferázt, hogy irányítsák a DNS-metilációt az emberi sejtekben (Weinberg és mtsai, 2006).

TE-k együttes adaptálása a gazdafunkciókhoz

Az evolúció során a transzpozonok bőséges jelenléte és mutációkat indukáló képessége háziasításukhoz vezetett (Miller et al., 1999). Ismeretes, hogy részt vesznek a szabályozó hálózatokban, például egy enhanszer jelet biztosítanak, amely át tudja irányítani a gazdagén expresszióját. Kísérletileg bebizonyosodott, hogy a humán promóterek csaknem 25%-a tartalmaz TE-kből származó szekvenciát (Jordan et al., 2003). Egy euther-specifikus transzponálható elem (MER20) hozzájárult a placenta-specifikus génszabályozó hálózat kialakulásához emlősökben azáltal, hogy fokozta a cAMP jelátviteli útvonalat az endometrium stromasejtekben (Lynch et al., 2011). Az intakt Drosophila telomer fenntartása a speciális retrotranszpozonok TART (telomer-asszociált retrotranszpozon) és HeT-A terminális transzpozícióihoz kapcsolódik (Levis et al., 1993). Az LTR I. osztályú endogén retrovírus (ERV) retroelemek 1500 p53 kötőhellyel rendelkeznek, amelyek az összes p53 kötőhely 30%-át teszik ki. Ezek az ERV-elemek főemlős-specifikusak, és alapos megértést adnak az endogén retrovírusokról, amelyek a p53 humán tumorszuppresszor fehérje transzkripciós hálózatát alakítják (Wang és mtsai, 2007). A V(D)J rekombináció változó (V), diverzitás (D) és egyesülő (J) génszegmensek speciális DNS-átrendeződése, amely fontos szerepet játszott a gerincesek immunrendszerének kialakulásában. A RAG1 és RAG2 fehérjék azok az alapvető komponensek, amelyek kölcsönhatásba lépnek a csatlakozási és átviteli tevékenységekért felelős rekombináz létrehozása érdekében. A V (változó), D (diverzitás) és J (csatlakozó) szegmensekhez csatlakozó rekombinációs szignálszekvenciák (RSS) felelősek a szekvenciaspecifikus hasításért és a RAG1/2 fehérjekomplex általi csatlakozásért (Gellert, 2002). Az egész mechanizmus nagyon emlékeztet egy transzpozíciós reakcióra, és a RAG1/2 képes katalizálni egy RSS-szel szegélyezett DNS-szakasz transzpozícióját in vitro (Agrawal és mtsai., 1998). A RAG1 katalitikus magja Transib elemekből, gerinctelenekben azonosított DNS-transzpozonok csoportjából fejlődött ki, és az RSS szerkezete a Transib Transposon TIR-ével való szekvencia-hasonlóságot mutat (Kapitonov és Jurka, 2005). Mindezekkel az eredményekkel együtt a V(D)J rekombináció a transzpozonok és a gazdagépezet sikeres együttes adaptációját és háziasítását jelenti.

Tc1/Mariner család és Csipkerózsika (SB) transzpozon rendszer

A Tc1/Mariner családok a legelterjedtebb DNS-transzpozoncsaládok, amelyek a növényektől az emberekig terjedő eukariótákban találhatók (Plasterk, 1999). Hosszúságuk 1,3 és 2,4 kb között változik, és egyetlen transzpozáz enzimet kódolnak (Ivics et al., 1997, Robertson, 1993). Ismétlődő elemként találták meg a C.elegans-ban (van Luenen et al., 1993), és amikor transzpozíciót észleltek, Tc1-nek nevezték (az 1. számú Caenorhaditis transzpozonra). A tengerészcsalád többi tagja többnyire különböző légyfajokban található (Bigot és mtsai., 1994, Capy és mtsai, 1994), de azóta már emberekben is előfordultak. A családba tartozó transzpozáz fehérjét a legtöbb transzpozázban és integrázban jelen lévő DDE vagy DDD motívum jellemzi, terminális fordított ismétlődésekkel és a TA szekvencia preferenciális integrációjával (Vos és Plasterk, 1994). Sajnos a Tc1/Mariner család legtöbb tagja inaktív, amit "vertikális inaktiváció" eredményez (Lohe et al., 1995). Ezenkívül a Drosophila hydei endogén Tc1-szerű elemét (TcE) sikeresen alkalmazták a légy Ceratitis capitata csíravonal transzgenezisében (Loukeris és mtsai, 1995). A halakban található többszörös inaktív Tc1/mariner elemek molekuláris rekonstrukciója a Csipkerózsika (Sleeping Beauty, SB) nevű aktív transzpozon feltámasztását eredményezte. Az SB a gerincesekben a legaktívabb és leginkább tanulmányozott transzpozon, két fő okból. Lehetőséget adott a gazda-transzpozon szabályozás és a gerincesek transzgenezisében és génterápiájában használható értékes, nem vírus alapú vektor megismerésére. Az SB transzpozon rendszer két fő komponensből áll, a transzpozonból a terminális fordított ismétlődésekkel (IR) mindkét oldalon, amelyek mindegyike két transzpozázkötő helyet (DR) tartalmaz, és a transzpozázból. Az IR-ek 230 bp hosszúak, és két 32 bp-os imperfect direct repeat (DR) nem egyenlő mindkét oldalon a bal IR-t tartalmazó UTR régióval, amely natív elrendezésében az SB-transzpozáz átírásának fokozójaként működhet. Az SB 340 aminosavból áll, és az N-terminális párosított DNS-kötő doménje felismeri a nukleáris transzportban részt vevő IR-eket és átfedő nukleáris lokalizációs szignálokat (NLS), és a jellegzetes DDE aláírással rendelkező C-terminális felelős a katalitikus aktivitásért. DNS hasításban, száltranszferben és kapcsolódási reakcióban (Ivics et al., 1997).

1. ábra: A Csipkerózsika transzpozáz szerkezete. A Csipkerózsika párosított DNS-kötő doménből, Nuclear Localization Signal (NLS) és C-terminális katalitikus doménből áll.

Egy tipikus SB-transzpozíció a transzpozáz IR-hez való kötődésével kezdődik, amelyet a szinaptikus komplexképződés követ, amelyben a két transzpozonvég közelebb kerül egymáshoz. Ezt követően kivágják a donor lókuszból, és újraintegrálódnak egy új lókuszba, amely viszont egy 5 bp lábnyom-mutációt hoz létre a donor helyen (Ivics et al., 1997).

1. ábra. A kivágás és beillesztés transzpozíció sematikus ábrázolása. A transzpozáz gént (kék doboz) a fordított ismétlődések (IR szürke nyilak) szegélyezik. A transzpozáz (zöld kör), az egyetlen fehérje, amely a transzpozíciós reakcióhoz szükséges, a fordított ismétlődésekhez kötődik, katalizálja a transzponálható elem kivágását a donor lókuszból (zöld vonalak), és közvetíti az elem integrációját egy új DNS lókuszba ( sárga vonalak). Az integrációs és donorhelyi DNS-töréseket a gazda DNS-javító gépezete javítja.

A részletes lépéseket egy sematikus diagram részletezi. Az SB-transzpozáz képes felismerni az IR-ket akár cisz, akár transz elrendezésben, ami lehetővé teszi a transzpozáz gén fizikai elkülönítését az IR-ektől. A transz elrendezés megkönnyíti bármely érdeklődésre számot tartó gén klónozását az IR-ek közé (ábra) egy erős promóter által vezérelt transzpozázzal, amely így értékes a genom-szerkesztéshez. A transzpozíciós reakció, mint kétkomponensű rendszer hatékonyságát azonban korlátozhatja a túltermelés gátlásnak nevezett jelenség, amely széles körben elterjedt a Tc1/mariner családban és az IR-ek közötti klónozott DNS-inszert rakodóképessége (Grabundzija et al., 2010).

1. ábra: A Csipkerózsika transzpozon rendszere. (A) A Csipkerózsika-transzpozon természetes elrendezése. A transzpozáz gént (kék doboz) a fordított ismétlődések (IR szürke nyilak) szegélyezik, amelyek tartalmazzák a transzpozázkötő helyeket (DR fehér nyilak). (B) A Sleeping Beautygene transzfer vektorrendszer laboratóriumi elrendezése. A transzpozázt kódoló régiót egy érdekes gén helyettesíti (zöld doboz).A transzpozázt egy külön plazmidvektoron biztosítjuk, amelyet egy megfelelő promóterből expresszálunk (kék nyíl).

A Tc1/mariner család, például a Tc1, Tc3, Himar1 és Mos1 leghatékonyabb transzpozon vektorrendszerének szisztematikus vizsgálata in vitro emlős sejttenyésztési vizsgálattal megállapította, hogy az SB a leghatékonyabb rendszer (Fischer et al., 2001). Az SB célhely-preferenciával rendelkezik a palindrom AT-ismétlődéshez, az ATATATAT-hoz, amelyben a központi TA a kanonikus célhely, és a transzpozíció után TA-dinukleotid duplikáción megy keresztül a célhelyen, amelyet a gazdajavító gépek javítanak ki. Ez a Tc1/Mariner család legaktívabb transzpozonrendszere, amelyet gerincesek genommanipulációjában és különféle génterápiás alkalmazásokban használnak (áttekintve: Mátés et al., 2007). Az in vitro evolúcióval végzett molekuláris rekonstrukció az SB új hiperaktív formáinak kialakulásához vezetett, amelyekben az SB100x a legaktívabb és támogatja a 35-50%-ban stabil géntranszfert humán primer sejtekben és 45%-ban stabil transzgenezist egérzigótákban (Mátés et al. , 2009)

Gazdálkodó tényezők és Csipkerózsika szabályozása

Az SB-transzpozon széles körű aktivitást mutat gerincesekben, eltérő hatékonysággal és ugyanazon faj különböző szöveteinek sejtjei között. A hatékonyságbeli különbség lehetséges magyarázata a transzponáló gépezet és a gazdatényezők kölcsönhatásának tulajdonítható. Mindazonáltal, ha a gazdafehérjék valóban részt vesznek a transzpozíciós reakcióban, akkor azokat meg kell őrizni gerincesekben. A nagy mobilitású fehérjék csoportjába tartozó, erősen konzervált DNS-hajlító fehérjét, a HMGB1-et először azonosították az SB transzpozíció kofaktoraként, amely szükséges a transzpozíció-transzpozon komplexekhez a belső DR-ekben (Zayed, 2003). Az SB transzpozíciója DNS kettős szálú törésekhez vezet, amelyekről kimutatták, hogy a gazdaszervezet javítógépei javítják. A Ku70, egy fontos fehérje, amely részt vesz a nem homológ végösszekötő javítási útvonalban, fizikai kölcsönhatásba lép az SB transzpozázzal, funkcionális kapcsolatot létesítve a gazda DNS-javítója között gépek és transzpozáz.(Izsvák et al., 2004).

Az SB transzponálható elem epigenetikai módosítása CpG metilációval a transzpozon szekvencián belül növeli az SB transzpozon transzpozíciós gyakoriságát (Yusa et al., 2004). Az SB egy másik gazdaszervezet által kódolt Miz-1 fehérjével való kölcsönhatása révén egy transzkripciós faktor leszabályozza a ciklin D1 expresszióját az emberi sejtekben, és indukálja a G1 lelassulását, ami önző cselekedetnek tekinthető a maximális transzpozíciós esemény érdekében (Walisko et al., 2006).

A HMG2L1 indukálja az 5′-UTR transzpozon transzkripcióját

A nagy mobilitású csoport-box (HMGB) fehérjék egyike a három HMG kromoszómális fehérje szupercsaládnak, amelyek további két nagy alcsoportba sorolhatók: Az 1. csoportba tartozó fehérjéknek több mint egy HMGB doménje van, hosszú savas C-terminális farokkal. sajátos szekvencia-specifitás. A 2. csoportba tartozó fehérjék csak egyetlen HMGB domént tartalmaznak bizonyos fokú szekvenciaspecifitással, és transzkripciós faktorként működhetnek (Bustin, 1999). Fontos megjegyezni, hogy a HMG2L1 a HMGB fehérjék második alcsoportjába tartozik. Kimutatták, hogy a HMG2L1 negatívan szabályozza a Wnt jelátvitelt egy új NLK-kötő fehérjével való kölcsönhatás révén (Yamada et al., 2003). További vizsgálatok kimutatták a simaizom-differenciálódás csillapításában betöltött szerepét (Zhou et al., 2010). Más gazdafehérjék után kutatva élesztő segítségével a két hibrid szűrés, amely esetleg kölcsönhatásba léphet az SB-transzpozázzal, egy másik nagy mobilitású fehérjét eredményezett, a HMG2L1-et (nagy mobilitású csoport protein 2-szerű 1). Ezáltal a nem transzlált régiót, ami elősegíti annak expresszióját, bár SB transzpozáz jelenlétében a HMG2L1-et negatívan szabályozza a visszacsatolás gátlása (Walisko et al., 2008).

Célok és célkitűzések

A transzponálható elemeket gyakran önző DNS-parazitáknak tekintik, amelyeket a genom ritkán vesz fel, hogy jótékony szerepet töltsön be. A transzpozíció magas szintje azonban negatívan befolyásolhatja a gazdaszervezet alkalmasságát, ami arra utal, hogy a sejtkörnyezetben a transzponálható elem szabályozása szigorú szabályozást igényel. A Csipkerózsika (SB) transzpozon a Tc1/mariner DNS-transzpozonok szupercsaládjának tagja, amelyet kivágás és beillesztés mechanizmussal mozgósítanak. Ebben a tanulmányban a Csipkerózsika (SB) transzponálható elemet használták gerincesekben a transzpozon-gazdasejt kölcsönhatások vizsgálatára.

A Csipkerózsika (SB) transzpozícióját nagymértékben szabályozzák a gazdasejt-tényezők. A transzpozáz expresszióját a transzpozon 5' UTR régiójában jelen lévő saját promótere irányítja. Nevezetesen, a transzkripciót jelentősen felszabályozza egy sejtfehérje, a HMG2L1. Mivel a HMG2L1 egy gyengén jellemezhető fehérje, nagy érdeklődés övezte a HMG2L1 fehérje aktivitását szabályozó fehérjekölcsönhatási hálózat tanulmányozását, mivel ez viszont modulálja a transzpozáz transzkripcióját és expresszióját.

A Sleeping Beauty (SB) transzpozon hatékony transzpozíciót mutat gerinces sejtekben és ugyanazon faj különböző szöveteinek sejtjeiben, de eltérő hatékonysággal. Egy lehetséges magyarázat a gazdafaktorok kifejeződése és szabályozása, amelyek szabályozhatják a transzpozíció hatékonyságát. Ez a tanulmány a zebradánt mint szervezetet használva a HMG2L1 fejlődési expresszióját és a transzpozáz dinamikus szabályozásában betöltött szerepét kívánta megfejteni a korai embrionális és csírasejtfejlődésben.

Csipkerózsika (Sleeping Beauty, SB) alapú integrációs rendszereket széles körben alkalmaznak gerincesek genetikai manipulálására. A cél az volt, hogy a rekombináció közvetített kazettacserével (RMCE) párosuló transzpozon alapú transzgenikusok erejét kihasználva egy olyan transzgenikus patkány modellt hozzanak létre, ahol a kérdéses transzgént újra be lehet irányítani a transzpozonokkal jelölt genomiális lókuszokba, hogy megkerüljék a pronukleáris injekció alapú problémákat. transzgenezis.


Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az ausztráliai Victoria Cancer Council (1066554) és a National Health and Medical Research Council (NHMRC) (1003667) támogatásai támogatták. Az MHK-t és a PKD-t az NHMRC vezető kutatói ösztöndíjai támogatták. Az ATP-t a Nemzeti Egészségügyi és Orvosi Kutatási Tanács (NHMRC) Karrierfejlesztési Ösztöndíja (1003856), az NHMRC program támogatása (1054618) támogatta, valamint a viktoriánus állam kormányának operatív infrastrukturális támogatása és az ausztrál kormány NHMRC független kutatóintézetének infrastruktúra-támogatási rendszere. . Köszönetet mondunk Dr. Carol Ginnsnek (Peter MacCallum Cancer Center, Melbourne, Victoria, Ausztrália 3002) tanácsaiért és megbeszéléséért a kromoszóma-integrációs helyek hatásáról a sejtfejlődésre és -működésre transzgenikus egerekben.