Információ

Melyik előbb, a PCR vagy a gélelektroforézis?


Ha ki akarom deríteni, hogy a betegek egy csoportjában abnormális BCR-ABL rákgén található, hogyan profitálhatok a PCR és a gélelektroforézis technikákból? Kicsit elvesztem annak meghatározásában, hogy melyik legyen előbb, és mi a pontos funkciója az egyes eszközöknek. A teljes génklónozási folyamatot elolvastam a biológiai könyvemben, de nem tudtam befogadni, mert annyira összetett.


A PCR az első. Ha a PCR megfelelően működik, akkor egy adott termék amplifikálódik. De nem láthatja a kis műanyag Eppendorf PCR csőben. Erre való az elektroforézis. A PCR futtatása után futtassa a termékeket agaróz gélen, hogy megjelenítse azt (némi fluoreszkáló festék segítségével). Az agaróz gél csak azért van, hogy megnézzük, működött-e a PCR.


Az első PCR és gél a Biomakespace-nél

A Mihály-napot az első gyakorlati foglalkozásunkkal zártuk az újonnan megnyílt Biomakespace-ben! Aznapi célunk az volt, hogy kipróbáljuk a Biomakespace létesítményeit PCR futtatásával, majd DNS-elektroforézissel – mindkettő nagyon fontos molekuláris biológiai technika.

A PCR, a polimeráz láncreakció rövidítése, egy rendkívül hasznos technika, amely lehetővé teszi számunkra, hogy egy DNS-templát molekula egy specifikus régióját tömegesen amplifikáljuk. Egy általánosan használt sablon a szövetekből vagy sejtekből kivont genomiális DNS, de mi a korábbi Cambridge iGEM csapatoktól visszamaradt BioBricks-válogatást használtuk. A BioBricks standardizált „biológiai komponensek” válogatottja, amelyeket nagyobb, cirkuláris DNS-molekulákba, úgynevezett plazmidokba inszertálnak. A BioBrickeket jellemzően 2-3 ng száraz DNS minták formájában osztják szét 384 lyukú műanyag lemezeken, amelyeket aznap vízben oldottunk fel.

Mivel a következő időszakban a Gibson-összeállítást tervezzük fényérzékeny genetikai áramkörök felépítésére, szelektíven akartuk elkülöníteni a szükséges szekvenciát a plazmid többi részétől, és testre szabni a végeket. Ehhez gondosan kiválasztott primereket kellett hozzáadnunk a PCR-mintákhoz. Múlt héten (17. 11. 19-én) volt egy találkozónk, ahol megvitattuk a jó primer-kiválasztás alapjait, és megterveztünk néhány primerkészletet, amelyek előrejelzései szerint felerősítik a kívánt szekvenciákat – köszönet Jarrod Shiltsnek, hogy segített ebben! A primerek kisméretű, körülbelül 20 nukleotid hosszúságú DNS-darabok, amelyek különböző cégektől egyedileg megrendelhetők. A miénk szárított DNS apró pelletjeként érkezett csövekben, amelyeket feloldottunk és a munkakoncentrációra hígítottunk. Volt néhány primerkészletünk: az egyik a BioBrick gének kódoló régióinak elejétől és végétől közvetlenül kötődni és amplifikálni kívánt, a másik két készlet pedig a közös szekvenciákból amplifikálódott azon plazmidok között, amelyekbe a BioBrickseinket beépítettük.

Amíg a PCR-ünk futott (egy meglehetősen antik termocikleren), felállítottuk a gélt, amelyet az általunk generált DNS-fragmensek elkülönítésére és megjelenítésére használtunk. A DNS elektroforézis azon a tényen alapul, hogy a DNS negatív töltésű, és így a katódról (negatív elektróda) ​​az anód (pozitív elektród) irányába mozog, ha elektromos térbe helyezik. A gél olyan környezetet biztosít, amely jobban lelassítja a nagyobb DNS-darabokat, mint a kisebbeket, ami azt jelenti, hogy a kisebbek gyorsabban vándorolnak, és így a DNS méret szerint elválik. Egy markerminta több ismert hosszúságú DNS-darabbal történő betöltésével megbecsülhető a DNS mérete más gélsávokban (például a mi PCR-amplifikált sávokban). Egy kis barkácsolást kellett végrehajtanunk, hogy a folyékony gél a formában maradjon, amíg megkötött, ami csak kis szivárgás mellett működött. Közvetlenül a kiöntés előtt adtunk hozzá egy festéket, amely fluoreszkál a DNS-sel érintkezve. A gél felfuttatását követően ez a festék lehetővé tette számunkra, hogy PCR-termékeinket fényes sávokként lássuk, amikor a fluorofort egy kék fényű átvilágító gerjesztette.

A zselés kép nem olyan tiszta, mint amennyire az ember szeretne (részben egy vacak telefonkamera miatt!), de nagyon világos sávok jelzik, hogy a legtöbb PCR sikeres volt! A sáv tartalma: mindkét oldalon a legkülső sáv tartalmazott egy-egy marker létrát, a 2-7. sávban közvetlenül a génkódoló régiók felett primerekkel amplifikált minták voltak (múlt héten tervezték), a 8-13. sávban a génkódoló régiók feletti generikus plazmid primerekkel amplifikált minták voltak. a BioBrick repository webhelyén a 14-19. sávokat hasonló általános plazmid primerekkel amplifikáltuk (szintén a múlt héten terveztük).

Szuper munka volt mindazoknak, akik segítettek az alapozó tervezésében és segítettek a gyakorlati munkában! Az eredmények azt mutatják, hogy számos primerkészletünk van, amelyek hasznosak lehetnek kiindulási pontként a Gibson-összeállításhoz szükséges szekvenciák előkészítéséhez szükséges túlnyúló primerek előállításához. Van néhány sáv, amely azonban nem várt eredményeket hozott. Például a 13. és 19. sáv, amelyek ugyanazt a sablont használták, nem mutatnak sávokat egyik általános primerkészletből sem. Ezzel szemben a 10. és 16. sáv olyan sávokat mutatott, amelyek kicsit nagyobbnak tűntek, mint amire számítottunk. Mindkét dolog további vizsgálatra szorulhat – erre lehet, hogy valamelyik projektmenedzserünknek lesz ideje a vakáció alatt.

Köszönet mindenkinek, aki ebben a tanévben eljött rendezvényeinkre és találkozóinkra, reméljük, hogy a téli vakáció után a dolgok izgalmasabbá válnak, amikor megpróbáljuk összeszerelni és beindítani fényérzékeny áramköreinket. E. coli baktériumok! Végezetül, nagyon köszönöm Katia Smith-Litière-nek és különösen Jenny Molloynak, hogy segítettek nekünk a papírmunkában, a rendelésben és egyebekben, amelyek lehetővé tették számunkra, hogy a Biomakespace-nél elindulhassunk ebben a tanévben.


Gél elektroforézis

Szerkesztőink áttekintik az Ön által beküldött tartalmakat, és eldöntik, hogy módosítsák-e a cikket.

Gél elektroforézis, a DNS-, RNS- vagy fehérjemolekulák méretük vagy elektromos töltésük alapján történő elválasztására használt számos technika bármelyike. A gélelektroforézisnek számos felhasználási területe van, például DNS-ujjlenyomat-vételben, valamint az egészséggel és betegségekkel kapcsolatos genetikai variánsok és fehérjék kimutatásában, valamint nukleinsavak és fehérjék kutatási célú kimutatásában és tisztításában. Használják a kórokozók (betegséget okozó szervezetek) kimutatására is, amelyek jelen lehetnek a vérben vagy más szövetekben vagy olyan forrásokban, mint például az élelmiszer. Sok esetben a gélelektroforézissel kimutatott és tisztított nukleinsavakat vagy fehérjéket tovább vizsgálják DNS-szekvenálás vagy tömegspektrometria segítségével.

A gélelektroforézis készülék egy gélből áll, amelyet gyakran agarból vagy poliakrilamidból készítenek, és egy elektroforetikus kamrából (jellemzően kemény műanyag dobozból vagy tartályból), amelynek egyik végén egy katód (negatív pólus) és egy anód (pozitív terminál) található. ellentétes vége. A gélt, amely egy sor lyukat tartalmaz a katód végén, a kamrába helyezzük, és pufferoldattal lefedjük. A mintákat ezután pipettával a lyukakba töltjük. A kamra egy tápegységhez csatlakozik, amely bekapcsolásakor elektromos mezőt fejt ki a pufferre. Az elektromos tér hatására a negatív töltésű molekulák a gélen keresztül az anód felé vándorolnak. (A DNS és az RNS negatív töltésű fehérjéket detergenssel kell kezelni, hogy negatív töltést kapjanak.) A molekulák mozgását a porózus gélmátrix úgy befolyásolja, hogy a nagyobb, nehezebb molekulák viszonylag lassan, míg a kisebb, könnyebb molekulák többet mozognak. gyorsan. A pórusok sűrűsége és a gél készítéséhez felhasznált anyag típusa tovább befolyásolja a molekulavándorlás sebességét. Gyakran egy festett „létrát” vagy több ismert és változó molekulatömegű molekulát tartalmazó markert futtatnak kísérleti minták mellett, hogy referenciaként szolgáljanak a mérethez. A festék lehetővé teszi a marker láthatóvá tételét, amint az áthalad a gélmintákon, amelyeket általában szintén festenek a megjelenítéshez. Az etidium-bromid néven ismert festéket, amely ultraibolya fényben fluoreszkál, gyakran használnak DNS-minták éles megjelenítésére.


A gélelektroforézis segítségével meg lehet találni a betegséggel kapcsolatos géneket

Ebben a szimulált esetben a kutatók olyan DNS-fragmenseket keresnek, amelyek csak gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegeknél találhatók meg.

Ezek a DNS-fragmensek „sávként” jelennek meg az elektroforézis eredményeiben (lásd a képet).

Ha a töredékek csak a betegségben szenvedőknél találhatók meg, ez arra utal, hogy a fragmentumok egy génváltozat DNS-ét tartalmazzák, ami azt jelentheti, hogy egy személy fogékonyabb a betegségre.

A képen hét különböző ember DNS-elemzésének eredménye látható. Az első sáv (1) egy „létrát” jelent, amely lehetővé teszi az elválasztott DNS-fragmensek méretének meghatározását.

Képzelje el, hogy a 2., 3., 4. és 5. lyukba töltött DNS a betegségben szenvedő betegektől származik, a 6., 7., 8. és 9. lyukba töltött DNS pedig olyan emberektől származik, akik nem szenvednek ebben a betegségben. Látja, hogy a betegségben szenvedő négy beteg közül háromnál van egy extra sáv a mintában?

A 2. sávba betöltött DNS-sel rendelkező személy szintén betegségben szenved, de az eredmények nem ugyanazt a sávozási mintát mutatják, mint a többi betegnél. Ez arra utal, hogy egynél több genetikai variáció is összefüggésbe hozható ezzel a betegséggel.


Segítség a PCR-ben és a gélelektroforézisben. Nem kapok egyetlen zenekart sem... (2012.07.07.)


Tud valaki segíteni vagy tanácsot adni. Diák vagyok, és már hetek óta sikertelenül próbálom amplifikálni az RNS-ből előállított cDNS-t, hogy befejezhessek egy olyan génszekvenciát, ahol körülbelül 40 nukleotidnyi rés van bennem.
Az RT-PCR első szálszintézist a Fermatas Revert Aid First Strand cDNS szintézis készlettel végeztem el, és 10 próbálkozás után kaptam egy sávot a következőkkel:
12ul MyTaq
1ul 18s Forward Primer
1ul 18s Reverse Primer
1 ul koncentrált cDNS
9,5 ul nukleázmentes H2O

Ez annak ellenőrzésére szolgál, hogy valóban cDNS termelődött-e.
Ezután primereket terveztek a körülbelül 45 nukleotidból álló "hiányzó szegmens" mindkét oldaláról.

A szóban forgó gén (POR-gén) amplifikálására több dolgot is kipróbáltam.
Kezdetben a következőket használtam:
16,25 ul nukleázmentes H20
5 ul puffer
0,5 ul dNTP-k
1 ul Fwd Primer
1 ul Rev Primer
1ul sablon
0,25 ul enzim (Phusion Hotstart II)

A használt PCR-körülmények a következők voltak:
1 ciklus:
98 oC-on 30 másodpercig
39 ciklus:
98oC 10 másodperc
54oC 30 másodperc
72oC 30 másodperc
1 ciklus:
72oC 5 perc

Most megpróbáltam megváltoztatni a következőket:
Váltás Velocity Enzyme-re
Beoltott PCR
Az enzimmennyiség felére csökkentése
A hosszabbítási idő csökkentése
Az izzítási hőmérséklet módosítása 54 oC-ról 50 oC-ra és 45 oC-ra
További sablon hozzáadása
Az izzítási idő 60 másodpercre növelve

A fentiek mindegyike egyáltalán nem eredményezett csíkokat vagy keneteket, vagy a PCR-terméket a gél futtatása után még mindig a lyukakban volt.

Most nagyon meg vagyok döbbenve, és örülnék néhány tanácsnak.
Remélem, mindent beleírtam ebbe a bejegyzésbe, amire szükségem van.

Előre is köszönöm.

Hogyan tervezték az alapozóit? Van valami különleges a sablonban (magas GC, alacsony GC?, szerkezet)?

Már van 2 szekvenciám, az egyik a gén 5' vége, a másik a 3' vége. Azonban van egy körülbelül 45 nukleotidnyi rés a közepén, amit próbálok felerősíteni. A primereket ezekből a szekvenciákból terveztük a rés mindkét oldalán, 20 nukleotid hosszúak és nem különösebben gazdagok GC-ben.

Ezek teljesen ésszerű alapozóknak tűnnek. Honnan tudod ennek a résnek a hosszát? Képes-e ugyanabból a templátmintából amplifikálni génje ismert régióit?
Talán a rés valójában egy intron, és Ön inkább a genomi DNS-t amplifikálta, mint a cDNS-t.

Végeztem egy Blast keresést, és összehasonlítottam a 2 szekvenciát, mint egy családból a ClustalW2 segítségével, és képet kaptunk a rés hosszáról.

És fel tudod erősíteni a cDNS-sablonodból a szekvenciáddal rendelkező részeket?
A genomi DNS-t amplifikálhatja a két primerrel. Ha rövid eredményt kap, akkor befedi a hiányt. Ha hosszú eredményt kap, tudni fogja, hogy van egy intron. Mi a végcél? Megpróbálod létrehozni a gént? Ha igen, akkor valószínűleg behelyettesítheti a látszólag megtalált homológ szekvenciák egyikét a hiányzó 9 aminosav helyett.

A már meglévő szekvenciákat több másikkal együtt egy másik kutatórészlegtől kaptuk meg, és amikor BLAST keresést végeztünk mindegyikben az adatbázisban, a két szekvenciánk az volt, amelyik POR génként jött létre, de van egy kicsi. hiányzik köztük a sorrend.

Tehát azt javaslom, hogy próbálja meg felerősíteni azokat a sorozatokat, amelyekről már tudja, hogy jelen vannak. Ez ellenőrzi, hogy a cDNS (vagy esetleg a genomi DNS) valóban jelen van-e, és megfelelő minőségű-e. Kipróbálnám a sablonod hígításait is.

Már kipróbáltam a sablon hígításait, de megpróbálom a már ismert szekvenciákat, köszönöm


Melyik előbb, a PCR vagy a gélelektroforézis? - Biológia

Biztos vagy ebben?

Ez a művelet nem visszavonható. Ezzel véglegesen törli az összes gyakorlott kérdést.

Biztos vagy ebben?

Ez a művelet nem visszavonható. Ezzel véglegesen törli az összes gyakorlott kérdést.

A tengeri gyomokból kivont agarózt felhasználták (AIMT Pre. - 2011)
1. Spektrofotometria
2. Szövettenyésztés
3. PCR
4. Gélelektroforézis

Megjegyzés hozzáadása

A 38 fejezet összes magyarázatának feloldásához be kell jelentkeznie a MasterClass Course-ra.

TÖBBET SZERETNÉM TUDNI

Az alábbi technikák közül melyik tette lehetővé élő szervezet génmanipulációját? (AIPMT Mains-2011)
1. Rekombináns DNS technikák
2. Röntgen-diffrakció
3. Nehezebb izotópos jelölés
4. Hibridizáció

Megjegyzés hozzáadása

A 38 fejezet összes magyarázatának feloldásához be kell jelentkeznie a MasterClass tanfolyamra.

TÖBBET SZERETNÉM TUDNI

A transzformációhoz a génpisztollyal bombázandó DNS-sel bevont mikrorészecskék a következőkből állnak: (AIPMT Pre. 2012)
1. Ezüst vagy platina
2. Platina vagy cink
3. Szilícium vagy platina
4. Arany vagy volfrám

Megjegyzés hozzáadása

A 38 fejezet összes magyarázatának feloldásához be kell jelentkeznie a MasterClass tanfolyamra.

TÖBBET SZERETNÉM TUDNI

Melyik igaz állítás a PCR-ben használt DNS-polimerázra vonatkozóan (AIPT, 2012 előtt)
1. A befogadó sejtbe bevitt DNS ligálására szolgál
2. Választható markerként szolgál
3. Vírusból izolálják
4. Magas hőmérsékleten is aktív marad

Megjegyzés hozzáadása

A 38 fejezet összes magyarázatának feloldásához be kell jelentkeznie a MasterClass tanfolyamra.

TÖBBET SZERETNÉM TUDNI

A PCR és a restrikciós fragmens hosszpolimorfizmus módszerei a következőkhöz: (AIPMT, 2012 előtt)
1. Az enzimek tanulmányozása
2. Genetikai transzformáció
3. DNS szekvenálás
4. Genetikai ujjlenyomat

Megjegyzés hozzáadása

A 38 fejezet összes magyarázatának feloldásához be kell jelentkeznie a MasterClass Course-ra.

TÖBBET SZERETNÉM TUDNI

Az alábbi ábra a pBR 322 E. Coli vektor vázlatos ábrázolása. A megadott opciók közül melyik azonosítja helyesen bizonyos komponenseit? (AIMT 2012 előtt)

1. ori - eredeti restrikciós enzim
2. rop-csökkentett ozmotikus nyomás
3. Hind III, EcoRI - szelektálható markerek
4. amp R , tet R - antibiotikum rezisztencia gének

Megjegyzés hozzáadása

A 38 fejezet összes magyarázatának feloldásához be kell jelentkeznie a MasterClass tanfolyamra.

TÖBBET SZERETNÉM TUDNI

Az alábbi ábra a polimeráz láncreakció (PCR) három lépését mutatja (A, B, C). Válassza ki a helyes 𠆊zonosítást és azt az opciót, amit képvisel?              (AIPMT Hálózat. - 2012)   

Lehetőségek:
1. B - Denaturálás körülbelül 98 °C hőmérsékleten, a két DNS-szál elválasztásával.
2. A - Denaturálás kb. 50ଌ hőmérsékleten
3. C - Extenzió hőstabil DNS polimeráz jelenlétében
4. A - Lágyítás két alapozókészlettel


  • Tudomány személyes és társadalmi perspektívában, F tartalmi szabvány „Számos betegség megelőzhető, kontrollálható vagy gyógyítható a tudományból szerzett ismeretekkel.”
  • A tartalmi szabvány: „A 9-12. évfolyamon végzett tevékenységek eredményeként minden tanulónak ki kell fejlesztenie a tudományos vizsgálódáshoz szükséges képességeket, a tudományos kutatással kapcsolatos ismereteket”
  • E tartalmi standard: „A 9-12. évfolyamon végzett tevékenységek eredményeként minden tanulónak fejlődnie kell a technológiai tervezési képességeken, a tudomány és technológia megértésében”
  • Észak-Karolina standard biológia tanfolyam, 1. cél
  • Észak-Karolina standard biológia tanulmányi kurzus, 3.04
  • Észak-Karolina standard biológia kurzus, 4.03. cél

Az enzimek nanoarmoringja: Polimerbe csomagolt enzimek racionális tervezése

Caterina M. Riccardi , . Challa V. Kumar, Methods in Enzymology, 2017

3.1 Enzim konjugáció PAA-hoz és jellemzés agaróz gél elektroforézissel

Agaróz gélelektroforézist végeztünk az enzimek oldatban lévő PAA-hoz való teljes konjugációjának igazolására (1A. ábra). A nanopáncélozott GOx–HRP–PAA (3. sáv) megnövekedett elektroforetikus mobilitást mutatott a pozitív elektróda felé, összehasonlítva a GOx/HRP (1. sáv) és GOx/HRP/PAA (2. sáv) kontrollokkal. A megnövekedett negatív töltés az enzim kovalens kötődésének (NH2 csoportok) a negatív töltésű PAA-hoz (COOH-csoportok), ami azt is jelzi, hogy az EDC reakció befejeződése után nem maradt konjugálatlan enzim (3. séma). Normális esetben az EDC reakció 40-50%-ban teljes, de teljes konjugációt értünk el az enzimek polimerhez viszonyított lehetséges optimális aránya, valamint a magas EDC koncentráció és a követett körülmények miatt. Egy másik ok, hogy maga az összekapcsolás várhatóan hatékony, mert a rendelkezésre álló karboxil- vagy amincsoportok 100%-ának nem kell reagálnia. Egy jelentős résznek reagálnia kell a rostos mátrixban lévő komponensek biztonságos összekapcsolására. Így jelentős hibahatár van, amely megengedett az alkatrészek teljes összekapcsolásához szükséges térhálósítás mértékében.

1. ábra . (A) A GOx–HRP–PAA konjugátum agaróz gélje oldatban (3. sáv, koncentrációarány 16:3:10 000 μM GOx:HRP:PAA), a GOx/HRP megfelelő kontrolljai (1. sáv, egyszerű keverék oldatban 16:3 μ koncentrációaránybanM GOx:HRP) és GOx/HRP/PAA fizikai keverék oldatban az EDC kezelés előtt (2. sáv). (B) A GOx-HRP-PAA konjugátum SDS-PAGE-ja (4. sáv) a megnövekedett molekulatömeget mutatja a GOx/HRP (2. sáv) és a GOx/HRP/PAA fizikai keverékek (3. sáv) megfelelő kontrolljaihoz képest. A standard molekulatömeg-markerek láthatók (1. és 5. sáv).

Reprodukálva: Riccardi, C. M., Mistri, D., Hart, O., Anuganti, M., Lin, Y., Kasi, R. M., &amp Kumar, C. V. (2016). A glükóz-oxidáz és a peroxidáz kovalens összekapcsolódása a papírüregekben: Enzim-polimer „pókhálók”. Chemical Communications, 52, 2593–2596.

3. séma. Amin és karboxilcsoportok közötti kémiai reakció, amelyet EDC katalizál.

Készítse elő az agaróz gélt (0,125 g agaróz) agaróz (0,5 tömeg/térfogat%) trisz-acetát pufferben (40 ml) készült oldatának mikrohullámú melegítésével.M, pH 7,0, 25 ml) 1 percig magas fokozaton. Mikrohullámú sütés után az agaróznak fel kell oldódnia.

Hagyja az agarózt a gélformában 30 percig dermedni.

Ezalatt 5-6 μ keveréssel készítsünk mintákatM töltőpufferrel (10 μL, 50% (v/v) glicerin és 0,1% (w/v) brómfenol kék).

Töltsön 15 μl mintát minden egyes lyukba. Betöltés után futtassa az agarózgélt 100 V-on 30 percig.

Festje meg a gélt briliánskék R250-nel (0,1%, w/v) 4 órán át, majd festse a gélt ecetsavval (10% v/v) egy éjszakán át.


10.1 Klónozás és géntechnológia

A biotechnológia mesterséges módszerek alkalmazása élő szervezetek vagy sejtek genetikai anyagának módosítására új vegyületek előállítására vagy új funkciók ellátására. A biotechnológiát a mezőgazdaság kezdete óta alkalmazzák az állattenyésztés és a növénytermesztés javítására a szelektív nemesítés révén. A DNS szerkezetének 1953-as felfedezése óta, és különösen a DNS manipulálására szolgáló eszközök és módszerek kifejlesztése óta az 1970-es években, a biotechnológia az organizmusok DNS-ének molekuláris szintű manipulációjának szinonimájává vált. Ennek a technológiának az elsődleges alkalmazásai a gyógyászatban (vakcinák és antibiotikumok előállítása) és a mezőgazdaságban (termények genetikai módosítása) vannak. A biotechnológiának számos ipari alkalmazása is van, mint például az erjesztés, az olajszennyezések kezelése és a bioüzemanyagok előállítása, valamint számos háztartási alkalmazás, például enzimek használata a mosószerben.

Genetikai anyag manipulálása

A fent leírt alkalmazások megvalósításához a biotechnológusoknak képesnek kell lenniük nukleinsavak kinyerésére, manipulálására és elemzésére.

Nukleinsav szerkezetének áttekintése

A nukleinsavakkal végzett munka alapvető technikáinak megértéséhez ne feledje, hogy a nukleinsavak nukleotidokból (cukorból, foszfátból és nitrogéntartalmú bázisból) álló makromolekulák. Az ezeken a molekulákon lévő foszfátcsoportok mindegyike negatív töltéssel rendelkezik. Az eukarióta szervezetek magjában található DNS-molekulák egész halmazát genomnak nevezzük. A DNS-nek két komplementer szála van, amelyeket hidrogénkötések kötnek össze a párosított bázisok között.

Az eukarióta sejtekben lévő DNS-től eltérően az RNS-molekulák elhagyják a sejtmagot. A hírvivő RNS-t (mRNS) a leggyakrabban elemzik, mivel ez a sejtben expresszálódó fehérjét kódoló géneket képviseli.

Nukleinsavak izolálása

A nukleinsavak tanulmányozásához vagy manipulálásához a DNS-t először ki kell vonni a sejtekből. Különféle technikákat alkalmaznak a különböző típusú DNS-ek kinyerésére (10.2. ábra). A legtöbb nukleinsav extrakciós technika magában foglalja a sejt feltörését, majd enzimes reakciók alkalmazását az összes nemkívánatos makromolekula elpusztítására. A sejteket puffervegyületeket tartalmazó detergens oldattal törjük fel. A lebomlás és a szennyeződés megelőzése érdekében a makromolekulákat, például a fehérjéket és az RNS-t enzimek segítségével inaktiválják. A DNS-t ezután alkohollal kiemelik az oldatból. A kapott DNS, mivel hosszú polimerekből áll, kocsonyás masszát képez.

Az RNS-t azért vizsgálják, hogy megértsék a sejtek génexpressziós mintáit. Az RNS természetesen nagyon instabil, mivel az RNS-t lebontó enzimek gyakran jelen vannak a természetben. Néhányat még a saját bőrünk is kiválaszt, és nagyon nehéz inaktiválni őket. A DNS extrakcióhoz hasonlóan az RNS extrakció is magában foglalja a különböző pufferek és enzimek használatát más makromolekulák inaktiválására és csak az RNS megőrzésére.

Gél elektroforézis

Mivel a nukleinsavak vizes környezetben semleges vagy lúgos pH-n negatív töltésű ionok, elektromos tér hatására mozgathatók. A gélelektroforézis a töltött molekulák méret és töltés alapján történő elválasztására szolgáló technika. A nukleinsavak teljes kromoszómákként vagy fragmentumokként választhatók el. A nukleinsavakat a gélmátrix egyik végén lévő résbe töltik, elektromos áramot vezetnek be, és a negatív töltésű molekulákat a gél másik vége felé (a pozitív elektróddal ellátott vége felé) húzzák. A kisebb molekulák gyorsabban mozognak a gél pórusain, mint a nagyobb molekulák, ez a migrációs sebességbeli különbség méret alapján választja el a fragmentumokat. A gélmátrixban lévő nukleinsavak mindaddig láthatatlanok, amíg meg nem festődnek egy olyan vegyülettel, amely lehetővé teszi a láthatóságot, például egy festékkel. A nukleinsavak különálló fragmensei méretük alapján meghatározott távolságra sávként jelennek meg a gél tetejétől (a negatív elektródvégtől) (10.3. ábra). Különböző méretű fragmentumok keveréke hosszú kenetként jelenik meg, míg a vágatlan genomi DNS általában túl nagy ahhoz, hogy átfusson a gélen, és egyetlen nagy sávot képez a gél tetején.

Polimeráz láncreakció

A DNS-elemzés gyakran megköveteli, hogy a genom egy vagy több specifikus régiójára összpontosítsunk. Gyakran előfordul olyan helyzet is, amikor a DNS-molekulának csak egy vagy néhány másolata áll rendelkezésre további elemzéshez. Ezek a mennyiségek nem elegendőek a legtöbb eljáráshoz, például gélelektroforézishez. A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan technika, amelyet a DNS meghatározott régióinak másolatainak számának gyors növelésére használnak további elemzésekhez (10.4. ábra). A PCR a DNS-polimeráz egy speciális formáját, a DNS-t replikáló enzimet és más rövid nukleotidszekvenciákat, úgynevezett primereket használ, amelyek a replikálandó DNS egy meghatározott részéhez bázispárosodnak. A PCR-t számos célra használják a laboratóriumokban. Ezek közé tartozik: 1) a tetthelyen hagyott DNS-minta tulajdonosának azonosítása 2) apasági vizsgálat 3) kis mennyiségű ősi DNS összehasonlítása modern élőlényekkel és 4) egy adott régió nukleotidszekvenciájának meghatározása.

Klónozás

Általában a klónozás tökéletes replika létrehozását jelenti. Jellemzően a szót egy genetikailag azonos másolat létrehozásának leírására használják. A biológiában a teljes szervezet újrateremtését „reproduktív klónozásnak” nevezik. Jóval azelőtt, hogy kísérleteket tettek volna egy egész szervezet klónozására, a kutatók megtanulták, hogyan másolják le a DNS rövid szakaszait – ezt a folyamatot molekuláris klónozásnak nevezik.

Molekuláris klónozás

A klónozás lehetővé teszi több génmásolat létrehozását, gének expresszióját és specifikus gének tanulmányozását. Ahhoz, hogy a DNS-fragmenst egy baktériumsejtbe másolható vagy expresszálható formában kerüljön be, a fragmentumot először egy plazmidba inszertáljuk. A plazmid (amelyet ebben az összefüggésben vektornak is neveznek) egy kis, kör alakú DNS-molekula, amely a baktériumokban a kromoszómális DNS-től függetlenül replikálódik. A klónozás során a plazmidmolekulák használhatók „vivőanyag” biztosítására, amelybe a kívánt DNS-fragmentumot be lehet illeszteni. A módosított plazmidokat általában újra beviszik egy bakteriális gazdaszervezetbe replikáció céljából. Ahogy a baktériumok osztódnak, lemásolják saját DNS-üket (beleértve a plazmidokat is). A beépített DNS-fragmenst a bakteriális DNS többi részével együtt másoljuk. A baktériumsejtben az emberi genomból (vagy más vizsgált szervezetből) származó DNS-fragmenst idegen DNS-nek nevezik, hogy megkülönböztesse azt a baktérium DNS-étől (a gazda DNS-étől).

A plazmidok természetesen előfordulnak baktériumpopulációkban (pl Escherichia coli), és olyan génekkel rendelkeznek, amelyek kedvező tulajdonságokkal járulhatnak hozzá a szervezethez, például antibiotikum-rezisztenciához (az antibiotikumokkal való nem befolyásolható képesség). A plazmidokat nagymértékben megtervezték, mint vektorokat molekuláris klónozáshoz és fontos molekulák, például inzulin, ezt követő nagy léptékű előállításához. A plazmidvektorok értékes jellemzője az idegen DNS-fragmens bejuttatásának egyszerűsége. Ezek a plazmidvektorok sok rövid DNS-szekvenciát tartalmaznak, amelyek különböző általánosan elérhető restrikciós enzimekkel vághatók. A restrikciós enzimek (más néven restrikciós endonukleázok) felismerik a specifikus DNS-szekvenciákat, és kiszámítható módon levágják azokat, amelyeket természetesen a baktériumok termelnek az idegen DNS elleni védekezési mechanizmusként. Sok restrikciós enzim lépcsőzetesen elvágja a DNS két szálát úgy, hogy a vágott végeken 2-4 nukleotidból álló egyszálú túlnyúlás van. A restrikciós enzim által felismert szekvencia egy négy-nyolc nukleotidból álló szekvencia, amely palindrom. A palindrom szóhoz hasonlóan ez azt jelenti, hogy a sorozat ugyanazt olvassa előre és hátra. A legtöbb esetben a szekvencia ugyanazt olvassa előre az egyik szálon, és visszafelé a komplementer szálon. Ha egy lépcsőzetes vágást ilyen sorrendben hajtunk végre, a túlnyúlások kiegészítik egymást (10.5. ábra).

Mivel ezek a túlnyúlások hidrogénkötés révén képesek újra egymáshoz jönni az ugyanazzal a restrikciós enzimmel vágott DNS-darabon lévő komplementer túlnyúlásokkal, ezeket „ragadós végeknek” nevezzük. Az egyszálú komplementer szekvenciák közötti hidrogénkötések létrehozásának folyamatát kettős szálú DNS-képződéshez nevezzük annealingnak. A DNS-ligáz nevű enzim hozzáadása, amely részt vesz a DNS-replikációban a sejtekben, tartósan összekapcsolja a DNS-fragmenseket, amikor a ragadós végek összeérnek. Ily módon bármely DNS-fragmens beilleszthető egy plazmid DNS két vége közé, amelyet ugyanazzal a restrikciós enzimmel vágtunk el (10.6. ábra).

A beléjük inszertált idegen DNS-t tartalmazó plazmidokat rekombináns DNS-molekuláknak nevezzük, mivel genetikai anyag új kombinációit tartalmazzák. A rekombináns DNS-molekulákból előállított fehérjéket rekombináns fehérjéknek nevezzük. Nem minden rekombináns plazmid képes gének expresszálására. A plazmidokat úgy is meg lehet tervezni, hogy csak bizonyos környezeti tényezők hatására expresszáljanak fehérjéket, így a tudósok ellenőrizni tudják a rekombináns fehérjék expresszióját.

Reproduktív klónozás

A reproduktív klónozás olyan módszer, amellyel egy teljes többsejtű szervezet klónját vagy azonos másolatát készítik. A legtöbb többsejtű szervezet szexuális úton szaporodik, ami magában foglalja a két egyed (szülő) DNS-ének közreműködését, ami lehetetlenné teszi bármelyik szülő azonos másolatának vagy klónjának létrehozását. A biotechnológia közelmúltbeli fejlődése lehetővé tette az emlősök laboratóriumi reproduktív klónozását.

A természetes szexuális szaporodás magában foglalja a spermium és a petesejt egyesülését a megtermékenyítés során. Ezen ivarsejtek mindegyike haploid, ami azt jelenti, hogy egy kromoszómakészletet tartalmaznak a magjukban. Az így létrejövő sejt vagy zigóta diploid, és két kromoszómakészletet tartalmaz. Ez a sejt mitotikusan osztódik, és többsejtű szervezetet hoz létre. Azonban egyetlen két sejt egyesülése sem tud életképes zigótát létrehozni, a petesejtek citoplazmájában vannak olyan összetevők, amelyek elengedhetetlenek az embrió korai fejlődéséhez az első néhány sejtosztódás során. E rendelkezések nélkül nem lenne későbbi fejlesztés. Ezért egy új egyed előállításához diploid genetikai komplementre és tojás citoplazmájára is szükség van. A mesterségesen klónozott egyed előállításának módja az egyik egyed petesejtjének eltávolítása és a haploid sejtmag eltávolítása. Ezután egy második egyed, a donor testsejtjéből származó diploid sejtmag kerül a petesejtbe. Ezután a tojást osztódásra serkentik, hogy a fejlődés folytatódjon. Ez egyszerűen hangzik, de valójában sok próbálkozásra van szükség, mielőtt minden lépés sikeresen befejeződik.

Az első klónozott mezőgazdasági állat Dolly volt, egy birka, aki 1996-ban született. A reproduktív klónozás sikeressége akkoriban nagyon alacsony volt. Dolly hat évig élt, és tüdődaganatban halt meg (10.7. ábra). Volt olyan spekuláció, hogy mivel a sejt DNS-e, amely Dollyt eredményezett, egy idősebb egyedtől származott, a DNS kora befolyásolhatta várható élettartamát. Dolly óta számos állatfajt (például lovakat, bikákat és kecskéket) sikeresen klónoztak.

Voltak kísérletek klónozott emberi embriók előállítására embrionális őssejtek forrásaként. Az eljárás során egy felnőtt ember DNS-ét egy emberi petesejtbe juttatják, amelyet aztán osztódásra serkentenek. A technológia hasonló a Dolly előállításához használt technológiához, de az embriót soha nem ültetik be béranyába. Az előállított sejteket embrionális őssejteknek nevezik, mivel képesek sokféle sejtté, például izom- vagy idegsejtekké fejlődni. Az őssejtek kutatásra használhatók, és végső soron terápiás alkalmazásokat is biztosíthatnak, például a sérült szövetek pótlását. A klónozás előnye ebben az esetben az, hogy az új szövetek regenerálására használt sejtek tökéletesen illeszkednek az eredeti DNS donorához. Például egy leukémiás betegnek nincs szüksége testvérre, akinek megfelelő szövete van a csontvelő-transzplantációhoz.

Vizuális kapcsolat

Miért volt Dolly finn-dorseti és nem skót Blackface bárány?

Génmanipuláció

A rekombináns DNS-technológiát a szervezet DNS-ének módosítására a kívánt tulajdonságok elérése érdekében génsebészetnek nevezik. Idegen DNS hozzáadása rekombináns DNS-vektorok formájában, amelyeket molekuláris klónozással állítanak elő, a génsebészet leggyakoribb módszere. A rekombináns DNS-t befogadó szervezetet genetikailag módosított szervezetnek (GMO) nevezik. Ha a bejuttatott idegen DNS egy másik fajból származik, a gazdaszervezetet transzgenikusnak nevezik. Bacteria, plants, and animals have been genetically modified since the early 1970s for academic, medical, agricultural, and industrial purposes. These applications will be examined in more detail in the next module.

Fogalmak akcióban

Watch this short video explaining how scientists create a transgenic animal.

Although the classic methods of studying the function of genes began with a given phenotype and determined the genetic basis of that phenotype, modern techniques allow researchers to start at the DNA sequence level and ask: "What does this gene or DNA element do?" This technique, called reverse genetics , has resulted in reversing the classical genetic methodology. One example of this method is analogous to damaging a body part to determine its function. An insect that loses a wing cannot fly, which means that the wing’s function is flight. The classic genetic method compares insects that cannot fly with insects that can fly, and observes that the non-flying insects have lost wings. Similarly in a reverse genetics approach, mutating or deleting genes provides researchers with clues about gene function. Alternately, reverse genetics can be used to cause a gene to overexpress itself to determine what phenotypic effects may occur.

Az Amazon munkatársaként a megfelelő vásárlásokból keresünk.

Szeretnéd idézni, megosztani vagy módosítani ezt a könyvet? Ez a könyv Creative Commons Attribution License 4.0, és OpenStax-ot kell rendelnie.

    Ha ezt a könyvet vagy annak egy részét nyomtatott formátumban terjeszti újra, akkor minden fizikai oldalon fel kell tüntetnie a következő utalást:

  • Használja az alábbi információkat az idézet létrehozásához. Javasoljuk ehhez hasonló hivatkozási eszköz használatát.
    • Authors: Samantha Fowler, Rebecca Roush, James Wise
    • Kiadó/webhely: OpenStax
    • Book title: Concepts of Biology
    • Megjelenés dátuma: 2013. április 25
    • Helyszín: Houston, Texas
    • Book URL: https://openstax.org/books/concepts-biology/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/concepts-biology/pages/10-1-cloning-and-genetic-engineering

    © 2021. január 12. OpenStax. Az OpenStax által készített tankönyvi tartalom Creative Commons Attribution License 4.0 licenc alatt áll. Az OpenStax név, az OpenStax logó, az OpenStax könyvborítók, az OpenStax CNX név és az OpenStax CNX logó nem tartozik a Creative Commons licenc hatálya alá, és nem reprodukálható a Rice University előzetes és kifejezett írásos hozzájárulása nélkül.


    Osama bin Laden: The Science of His End

    "DNA is a charged molecule. Consequently, DNA molecules will move when an electrical field is applied to a liquid in which they are dissolved. If the liquid is a simple one--such as water with some salts in it--all the DNA molecules move at nearly the same speed. Under those conditions, it is hard to distinguish the tiny disparities in the motion of different kinds of DNA.

    "If the solution is made less liquid, as in a gel, and the DNA molecules all start moving across the solution from some initial small volume--that is, from essentially the same staring point--then the molecules can move at perceptibly different speeds. Usually smaller DNA molecules move faster than larger ones. After a while, the molecules are separated by size. If the molecules fall into only a few discreet sizes, then bands (little rectangles) of DNA will appear in the gel. Each of these bands contains DNA strands of a specific size."

    [Editors note: DNA fingerprinting uses gel electrophoresis to distinguish between samples of the genetic material. The human DNA molecules are treated with enzymes that chop them at certain characteristic points, thereby reducing the DNA to a collection of more manageably sized pieces. The DNA fragments are loaded into a gel and placed in an electrical field, which electrophoretically sorts the DNA fragments into various bands. These bands can be colored with a radioactive dye to make them visible to imaging techniques.]

    "For individual people, the bands of DNA created through this process will have a pattern that is specific to the individual. Part of this pattern comes from the size of the DNA part of it comes from the sequence of the DNA of a specific size.


    Nézd meg a videót: Gel Electrophoresis and PCR My Procedure (Január 2022).