Információ

Hogyan oszlik el a zöld fluoreszcens fehérje a szervezetben?


Szeretnék tudni egy viszonylag egyszerű dolgot, de valami, amire nem találtam választ. Ha a fluoreszkáló fehérjét viszonylag nagy, nem átlátszó állatban, például egérben, vagy elméletileg kutyában vagy emberben használják, hogyan épül be a fehérje általában a szövetbe? Feltételezem, hogy kötődne az elasztinhoz, és különben különböző sejtekbe transzfektálódhatna a szövetekben és a szövetekben, mind a bőr körül, mind a mélyebben. Azonban nem csak a bőr közelében lenne hasznos, mivel az ultraibolya fény és a látható fény korlátozott távolságra áthatol a szöveteken? Viszont egy viszonylag fényes fényforrás esetleg a szövet mélyebb rétegeiből tud fényt termelni. Nem vagyok benne biztos. Ez egy viszonylag egyszerű kérdés, de nagyra értékelem.

(Szerk.): Lehet, hogy kicsit homályosan fogalmaztam a kérdést, a feltett kérdés konkrétabb változata lenne; Figyelembe véve a fluoreszkáló fényforrás fényerejét, amely a fluoreszcens fehérjével töltött szövetre irányul (az UV -vel feltételezhetően közel van a látható spektrumhoz), és a fénynek azt a részét, amely látható fénnyé alakul, körülbelül hogyan tudná kiszámítani a fényviszony relatív fényerejét? a fehérjét a szövet bizonyos mélységében. Természetesen valószínűleg nagyon nehéz pontosságot szerezni ezzel, mert ez a zsír-, izom-, kollagén- stb. Szöveti részétől függ. De ha van valami durva és általános, például a fehérje mélysége csökkentené relatív fényerejét a természetes napló milliméterenként, vagy valami ilyesmi, akkor jó lenne.


A GFP megoszlása

Ha riporterként használják, a GFP -t általában a sejtek expresszálják, vagy egy antitesthez kapcsolják, és injektálják. Mindenhol vége, erre gondolok.

A GFP lokalizálása

Három megoldás létezik a fluoreszcencia szövetek mögött rejtett problémájára.

  1. Használjon funkcionálisan 2D mintát (fonálférgek, egérvégtagok stb.)
  2. Feláldozza a szervezetet (ha még nem halt meg), és használjon optikai tisztítást
  3. Okosság

Ezek közül az okosság a legérdekesebb. Az okosság típusai közé tartozik az időfelbontású képalkotás (a fény azonnal szétszóródik, de a legtöbb fluoreszcens fehérje néhány nanomásodperc alatt ellazul), hogy elkülönítse a fluoreszcenciát a visszaszórástól. Gerjesztsen egy szeletet a mintából, és nézze meg enyhe szögből 3 ns múlva, és látnia kell egy mélységtérképet. Ismétlés.

Használhat optikai tomográfiát is, hogy alapvetően számítógépeket és sok kamerát használjon a késleltetett képalkotás helyett a jel 3D eloszlásának megoldására. A komputertomográfia sokkal olcsóbb, leginkább azért, mert nem kell hozzá nanoszekundumos léptékű lézer + rögzítő rendszer (ezek drágák).


A GFP jelentése zöld fluoreszkáló fehérje (a molekula hivatalos neve), és fantáziadúsan olyan fehérje, amely zöld fényben fluoreszkál UV fény jelenlétében [1]. Alkalmazását a sejtbiológia minden területén megtalálta, és az előrelépések elérték azt a pontot, ahol a műalkotások középpontjában állnak [2], mint például az Alba nevű kedvtelésből tartott nyúl, akinek bundája zölden izzott az UV fényben. 2008 novemberében három férfi, Osamu Shimomura, Martin Chalfie és Roger Tsien kapott kémiai Nobel-díjat [3-7] "a zöld fluoreszcens fehérje felfedezéséért és fejlesztéséért". Tehát mi teszi ezt ilyen sokoldalú és fontos molekulává?

Idősebb Plinius az első században arról számolt be, hogy bizonyos medúzák izzó fényt produkálnak [8]. Ez volt az első jelentés biolumineszcencia. Mi tehát a biolumineszcencia? Egyszerűen fogalmazva, ez az, amikor egy biológiai szervezet fényt bocsát ki. Ennek gyakori példája a szentjánosbogár és hasonló szervezetek, amint az az 1. ábrán látható [9], ahol a luciferin fehérje és a luciferáz enzim [10] oxigénnel és ATP-vel, az élő szervezetek energiaforrásával kombinálódnak. fényt termelni. Egy másik példa a mélytengeri halakra, amelyek hasonló rendszert használnak, hogy fényt állítsanak elő a csaliban, és vonzzák a zsákmányt, amelyet aztán ehetnek.

1.ábra. Példa a luciferin/luciferáz reakcióra.
[Reprodukálva a Ref. 9].

Tehát miben különbözik ez a fluoreszcenciától? Fluoreszcenciában a beeső fényt más, kevésbé energikus hullámhosszon bocsátják ki. A fluoreszcencia akkor működik, amikor egy foton összeütközik egy molekulával, és ezáltal a molekula energiát nyer. Ha ez az energia elegendő, az elektron a kezdeti alapállapotból egy magasabb energiájú állapotba gerjesztődik, és minden felesleges energia hatására a molekula jobban rezeg vagy gyorsabban mozog. A gerjesztett molekula lassan elveszíti rezgési és transzlációs energiáját, leggyakrabban a környező molekulákkal való ütközés vagy a szerkezet átrendeződése következtében, de néha más módszerekkel is. Hosszú idő, nagyjából néhány mikroszekundum elteltével a molekula elveszítheti a gerjesztett elektronban tárolt energiát azáltal, hogy visszaesik alapállapotába. Ezzel az eséssel az elektron a gerjesztett és az alapállapot közötti különbséggel megegyező energiájú fotont bocsát ki. A rezgési és transzlációs energia elvesztése miatt az elnyelt és kibocsátott fotonok energiája eltér, megváltoztatva a kibocsátott fény színét [11], például. a kék fény elnyelése és a zöld kibocsátása.


Mi a nagy üzlet?

Bizonyos medúzák gyönyörű zöld fényt bocsátanak ki. Bár még mindig rejtély, hogy a medúzák miért akarnak világítani a sötétben, az ezekből az állatokból származó zöld fluoreszcens fehérje (GFP) a természet ajándékának bizonyult, amely átalakította a sejtbiológiát. Három tudóst Nobel-díjjal ismertek el a GFP-vel kapcsolatos munkájukért, bár mások fontos módon járultak hozzá, amint azt ebből a történetből látni fogja. Miért nagy ügy a GFP? A GFP és a nagyon érzékeny kamerákkal felszerelt mikroszkópok kombinációjával a tudósok hihetetlen filmeket kezdtek készíteni az ezen a mikroszkopikus szinten zajló élet dinamikus folyamatairól. Talán láttad a „Föld bolygót” és az állatok elképesztő filmezését ezekben a videókban. Most ugyanilyen elképesztő filmek készülnek az élő sejtek belső működéséről, amelyek lehetővé teszik számunkra, hogy lássuk, mikor és hol fejeződnek ki a gének, valamint más dinamikus folyamatok, amelyek lehetővé teszik az életet. A GFP megadta nekünk a „Planet Cell” létrehozásához szükséges eszközöket. A GFP a tudósok elképesztő kreativitását is felszabadította. A GFP-t „végtelen, legszebb és legcsodálatosabb formákká” alakították át (Darwint idézve). Ma már minden színű fluoreszcens fehérje létezik, be- és kikapcsolható változatok, valamint módosított változatok, amelyek érzékelik és jelentést készítenek a sejten belüli állapotokról. És az egész egy megtévesztően egyszerű kísérlettel kezdődött. A GFP története egy leckét is tartalmaz a fiatal tudósok számára – ne tántorítsa el magát másoktól, akik azt mondják: „nem, ez a kísérlet nem fog működni”. Hagyjuk, hogy Marty Chalfie és Ghia Euskirchen elvigyék Önt egy körútra arról, hogy mit tettek, így első helyet foglalnak el a GFP forradalom születésével.


KOMMENTÁR

Háttér-információ

Az FFP -k tervezésével és alkalmazásával kapcsolatos szempontok

A különböző fluoreszkáló fehérjéknek (FP) különböző előnyei és korlátai vannak. Az FFP megtervezése és létrehozása előtt a vizsgálónak meg kell határoznia, hogy az FFP milyen kérdésekre lesz felhasználva. Érdemes egy kis időt szánni arra a kérdésre, hogy a tervezett konstrukció képes lesz -e teljesíteni a kitűzött célt. További aggályok közé tartozik, hogy az FFP kellően világos lesz -e, megfelelő lesz -e a tervezett kísérlet időskálájához, és rendelkezésre áll -e az alkalmazáshoz szükséges felszerelés.

A legegyszerűbb fluoreszcens fúziós fehérjék (FFP -k) a célzó szekvenciákhoz (például nukleáris lokalizációs szekvenciához vagy szignálszekvenciához) fuzionált FP -k az organellák vagy a sejtszintű domén kiemelésére. Az ilyen FFP-k lehetővé teszik a kutató számára, hogy kolokalizálja a kívánt fehérjét egy adott organellával, vagy kövesse az organellák dinamikáját egy élő sejtben (Lippincott-Schwartz et al., 2001 Miyawaki et al., 2003). Ezenkívül ezek az FFP -k kombinálhatók fotófehérítési módszerekkel (EGYSÉG 21.1) a sejtes környezet viszkozitásának vagy zsúfoltságának vizsgálatára (Dayel et al., 2000 Nehls et al., 2000 Lippincott-Schwartz et al., 2001). Az FP-vel fuzionált teljes hosszúságú fehérjét tartalmazó FFP-k potenciálisan értékes eszközök, amelyek kihasználhatók egy fehérje funkciójának vagy viselkedésének megvilágítására a natív környezetben.

Mennyi a fluoreszkáló fehérje?

Az első kérdés, amelyet alaposan meg kell fontolni, az érdeklődő fehérje normális expressziós szintje. A különböző fehérjék expressziós szintjeit a 21.4.1. Táblázat tartalmazza. Hasonlítsa össze ezeket az értékeket az FP koncentrációival, amelyek a sejtek háttér -fluoreszcenciáján keresztül történő megjelenítéshez szükségesek. Például ahhoz, hogy a fluoreszcencia kétszeres növekedését elérjük a háttérfluoreszcenciához képest, a fokozott zöld fluoreszkáló fehérjét (EGFP) 200 nM -on kell kifejezni (Patterson és mtsai, 1997). Így egy homogén eloszlású citoplazmatikus FFP megjelenítéséhez az FFP-t két nagyságrenddel magasabb szinten kell kifejezni, mint egy kináz, például a MAPKKK (21.4.1. táblázat). Ha azonban az összes FFP különálló kompartmentekben vagy doménekben koncentrálódik, akkor az alacsony expressziós szintek elegendőek lehetnek a kívánt fehérje vagy organellum láthatóvá tételéhez, ezzel szemben, ha egy fehérje normálisan kötődik egy alacsony szinten jelenlévő receptorhoz, akkor a felesleges fluoreszcencia. A nem kötött FFP mennyisége elfedheti a fiziológiailag releváns populációt. Ennél is fontosabb, hogy nem szabad alábecsülni a túlexpresszált fehérje lehetséges biológiai következményeit. Ezért a normális expressziós szintek és az érdeklődő fehérje lokalizációjának ismerete nagyban segítheti a kísérletek tervezését és értelmezését. A fehérje relatív expressziós szintjének meghatározásához a vizsgáló összehasonlíthatja a kérdéses fehérjét natívan expresszáló sejtek lizátumaiból származó immunblotokat és az FFP-vel stabilan transzfektált sejtek lizátumait, ugyanazt az antitestet használva a natív fehérjéhez és az FFP-hez.EGYSÉG 6.2).


Az élet zöldre festése: GFP

A medúzától az arzéndetektorokig a Nobel-díjon keresztül: Sonia Furtado beszámol a zöld fluoreszcens fehérje felfedezéséről és fejlesztéséről, valamint interjúkat készít a németországi heidelbergi Európai Molekuláris Biológiai Laboratórium (EMBL) tudósaival annak alkalmazásairól.


Tojássá érni ezt az egeret
a petesejt osztódik. GFP-t használtunk
hogy megjelölje a sejt aktin citoszkeletonját
zöld és a kromoszómák vörösek

A kép jóvoltából Jan Ellenberg / EMBL

Medúzával kezdődött: átlátszó Aequorea victoria pereme körül zölden ragyogó foltok vannak, amikor izgatottan viselkednek, amit először a tudósok írtak le 1955 -ben. Ennek a „furcsaságnak” a tanulmányozása tudományos forradalomnak, és három tudós számára Nobel -díjnak nevezett eseményhez vezetett w1. Mindezt egyetlen fehérje, az úgynevezett zöld fluoreszkáló fehérje (GFP) miatt, amely felelős a medúza fluoreszcenciájáért.

Az 1960-as évek elején Osamu Shimomura japán tudós felfedezte az aequorint, egy medúzafehérjét, amely kalcium jelenlétében világít. Az aequorin azonban kéken világít, míg a medúza zölden világít, tehát valaminek át kell alakítania az aequorin kék fényét a medúza zöld fényévé. Shimomura felfedezte, hogy ez valami más fehérje: a GFP, amely elnyeli az aequorin kék és ultraibolya fényét, és zöld fényt bocsát ki, így ragyog a medúza.

Hozzájárult Martin Chalfie amerikai biológus is azzal az ötlettel, hogy hogyan lehetne kihasználni ezt a hatást: úgy érvelt, hogy a modellszervezetek genetikailag módosíthatók, ha a GFP génjét egy meghatározott génhez kapcsolják, amelyet a tudósok tanulmányozni akarnak. Ezután, amikor az érdeklődésre számot tartó gént expresszálták, azaz amikor az általa kódolt fehérjét előállították, GFP kapcsolódott hozzá. Ez lehetővé tenné a tudósok számára, hogy mikor és hol kapcsolják be az adott gént: csak ultraibolya fényt kell beragyogniuk a szervezetükbe, és keresniük kell a zöld fényt.

Ekkor nyilvánvalóan két dolog hiányzott, mielőtt Chalfie elképzelése valóra válhatott. Meg kellett határozni a GFP génjét, és le kellett tárni a GFP fluoreszcencia mögött álló mechanizmust. A tudósok tudták, hogy a GFP azért világít, mert három aminosavja fluorofort képez, egy kémiai csoportot, amely elnyeli és kibocsátja a fényt. Feltételezték, hogy az akkoriban ismert legtöbb természetesen fluoreszkáló molekulához hasonlóan más fehérjékre, úgynevezett enzimekre lesz szükség ahhoz, hogy a GFP-t a megfelelő formára hajtsák, és úgy gondolták, hogy csak A. victoria gyártaná őket.

Tehát amikor Douglas Prasher biokémikus 1992-ben azonosította a GFP gént, az általános egyetértés az volt, hogy ennek a génnek más szervezetekbe történő bevezetése a GFP nem fluoreszkáló változatának előállítását eredményezi. Amikor azonban Chalfie és csapata az újonnan talált GFP gént egy baktérium DNS -hez csatolta, a baktériumok zölden világítottak!

Kiderült, hogy a GFP -nek nincs szüksége enzimekre, hogy ragyogjon. Ehelyett spontán módon fluoreszkáló alakra gyűrődik, és Roger Tsien biokémikus felfedezte, hogy a fluorofor aminosavai közötti reakcióhoz csak oxigénre van szükség, amely a legtöbb élő sejtben könnyen elérhető.


Chalfie kísérlete: A GFP génjét tartalmazó DNS-t egy C. elegans féreg ivarmirigyébe fecskendezték be (a). A féreg hermafrodita, így képes megtermékenyíteni magát, és a GFP gén sok petében jelen volt, amelyet akkor lerakott (b). A tojások felosztódtak (c), új egyedeket képezve (d), akiknek az érintési receptor neuronjai zölden világítottak az ultraibolya fényben (e). Kattintson a kép nagyításához
A kép a Typoform / Svéd Királyi Tudományos Akadémia (RSAS) jóvoltából


A GFP aminosavlánca összecsukódik
henger alakú, azzal
a fluorofor a közepén

A kép a Typoform jóvoltából /
a Svéd Királyi Akadémia
Tudományok (RSAS)

Miután Tsien pontosan meghatározta a GFP fluorofórjának kialakulását, Tsien képes volt manipulálni ezt a fehérjét. A lánc különböző részein a különböző aminosavak cseréjével a GFP új változatait fejlesztette ki, amelyek világosabbak voltak, különböző hullámhosszúságú fényt nyeltek el, és különböző színekben izzottak: cián, kék és sárga. És amikor egy vörös fluoreszkáló fehérjét találtak a korallokban, Tsien és kollégái a GFP -re vonatkozó ismereteiket felhasználva azt a vörös fluoreszcens fehérjét biológiai markerként is felhasználhatóvá tették.

Shimomura, Chalfie és Tsien 2008 -ban elnyerték a kémiai Nobel -díjat „a zöld fluoreszcens fehérje felfedezéséért és kifejlesztéséért”, a tudósok pedig a világ minden tájáról folytatják a GFP változatainak kifejlesztését, amelyek ma már szinte minden színben elérhetők a szivárvány.

Mára a GFP felbecsülhetetlen értékű eszközzé vált a tudósok számára világszerte. Sokkal kevesebb kárt okoz a sejtekben, mint a kémiai fluoreszkáló markerek. Egy bizonyos ideig tartó megvilágítás után a fluorofór elektronot bocsát ki, és ezt követően soha többé nem fluoreszkál: fehéríti.

Az ebben a fehérítési folyamatban felszabaduló elektronok nagyon gyorsan reagálnak az oxigénnel, és nagyon mérgező oxigéngyököket képeznek, amelyek károsítják a sejtek összetevőit, és végül a sejtek halálát okozzák. De a GFP szerkezete pajzsként működik, védi a sejtet. Amikor a fluorofór elektronot szabadít fel, a képződött gyökök reagálnak a GFP -n belül, így károsítják a GFP -t, de nem a sejtet.

És bár a tudósok GFP -t használnak markerként azáltal, hogy egy adott fehérjéhez kapcsolják, a különböző kutatók arra használják, hogy tanulmányozzák a különböző folyamatokat, amelyek teljesen különböző skálákon játszódnak le, bármit megjelölve a sejtcsoportoktól az egyes molekulákig.

„Ez a GFP szépsége” – mondja Darren Gilmour, az EMBL w2 tudósa: „Ezzel megtekintheti ezeket a különböző skálákat – mindegyiket lefestheti ugyanazzal a festékkel, nem kell ecsetet cserélnie. ”


Egy sejtcsoport, megjelölve
narancssárga, más sejteket irányít
(zöld), ahogy vándorolnak
fejlődő zebrafish embrió

A kép Darren jóvoltából
Gilmour / EMBL

A zebrahalak embrióival foglalkozó munkájukban Darren és csoportja a GFP segítségével jelöli meg a sejtcsoportokat, amelyeket aztán követhetnek az embrió fejlődése közben, figyelve, hogyan viselkednek, merre mennek, és végül milyen szöveteket és szerveket szülnek. A Darren által vizsgált zebrahal embriók átlátszóak, így azt gondolhatnánk, hogy könnyű látni, mi történik bennük. Darren szerint a probléma az, hogy túl sok minden történik. „Ez túlterhelés. Egyszerűen nem tudsz összpontosítani, nem tudsz egyetlen dolgot kiválasztani. De a GFP-vel – teszi hozzá –, lekapcsolhatja a lámpákat, és csak egy sejtcsoportra, vagy akár egyetlen cellára fókuszálhat. (Ha többet szeretne tudni Darren munkásságáról, lásd: Spinney, 2007).

Ez a dinamikus folyamatok követésének képessége döntő fontosságú Francesca Peri számára is, hiszen így napokon át mikroszkóp alatt követheti nyomon jelzett zebrahal embrióinak fejlődését. Alternatív megoldás lehet az állat feláldozása, szeletelése és állóképek készítése. "Olyan lenne, mintha csak féltucat fénykép alapján próbálnánk megérteni egy focimeccset" - mondja Francesca. - Sosem kapná meg a teljes képet. Ő és csoportja mikrogliákat tanulmányoznak, olyan sejteket, amelyek képesek elhaló vagy sérült idegsejteket enni. „A GFP segítségével színkódolhatjuk a különböző sejttípusokat, így például a mikrogliákat zöldre, a neuronokat pedig pirosra jelöljük. Tehát ha egy vörös sejtet látunk egy zöldben, tudjuk, hogy egy neuront megettünk, hogy ne károsítsa az agyszövet többi részét. ”


A GFP segítségével a tudósok megnézhetik
élő zebrafish embrió
az egész agyat, figyelje meg a kölcsönhatásokat
mikroglia (zöld) és
neuronokat (piros), és találjon neuronokat
belső mikroglia (világos piros)

A kép Francesca Peri jóvoltából
/ EMBL


Az Arabidopsis ezen a 3D -s képén
növény hajtáscsúcsos merisztémája, amely
föld feletti
a növény része, fluoreszkáló fehérjék
sejtmembránok jelölésére használták
zöld és magjai rózsaszínűek

A kép Ernst Stelzer jóvoltából /
Marcus Heisler / EMBL


Számítógépes szimulációk kombinálása
a GFP címkézéssel a tudósok képesek
összehasonlítani előrejelzéseiket
(kék) a valós helyszínnel
sejtmagok (narancssárga)

A kép jóvoltából Marcus Heisler
/ EMBL

Marcus Heisler és csoportja a GFP -t és annak változatait használja a növények tanulmányozására. Az auxin nevű növényi hormonra összpontosítanak, amelyet a sejtmembránon elhelyezkedő hordozó szállít a sejt külső részébe. Ez a hordozó mozoghat a sejtben, megváltoztatva a hormon küldésének irányát. „A GFP lehetővé teszi számunkra, hogy kövessük ezt a nagyon dinamikus folyamatot az élő növényekben - mondja Marcus -, és jó 3D felbontást biztosít számunkra.”

A GFP megbízhatósága kulcsfontosságú az ilyen 3D-s képek készítéséhez, mondja Ernst Stelzer, akinek csoportja a 3D-s képalkotási technológiák idővel történő fejlesztésére összpontosít. "A festék vastag mintába kerülése mindig nagyon komoly probléma." mondja.A mintákba fecskendezett markerek általában nem hatolnak át jól, ezért a címkézés általában egyenetlen: a külső rétegek jól címkézhetők, de a középső rétegek általában rosszul címkéznek, ha egyáltalán. „A GFP -vel - mutat rá Ernst - valóban biztosak lehetünk abban, hogy az egész minta címkézett lesz, mert a festék a sejteken belül keletkezik.”

Az EMBL egy másik tudósa, Rainer Pepperkok azt mondja: „A GFP-vel valóban molekuláris biológiát végezhetünk sejtekben, miközben a dolgok mozognak, nem pedig kémcsőben.” Ő és más tudósok kihasználják azt a tényt, hogy a GFP ma már sokféle színben kapható, és kiaknázzák a fluoreszcens rezonancia energiaátvitelnek (FRET) nevezett fizikai jelenséget.

Ez a jelenség akkor fordul elő, amikor két különböző színű fluoreszcens molekula – klasszikusan vörös és zöld – közel kerül egymáshoz. Ha ezután a zöld ultraibolya vagy kék fényt kap, akkor elnyeli ezt a fényt, és a fény energiájának egy részét átadja a vörös molekulának, amely ezután vörös fényt bocsát ki, hasonlóan ahhoz, ahogy a kéknek köszönhetően zölden világít a medúzában a GFP. aequorin által kibocsátott fény. „Tehát ha van egy fehérje, amely zöld GFP -vel és egy másik RFP -vel (vörös fluoreszkáló fehérje) van megjelölve - magyarázza Rainer -, ha kölcsönhatásba lépnek egymással, a piros világosabb lesz, a zöld pedig halványabb.”

A GFP különféle felhasználási módjai ellenére, vagy talán éppen ezek miatt, a tudósok még mindig nem elégedettek. Gyakori kérés a GFP-k, amelyek vörös vagy akár infravörös fényben világítanak, mivel ez jobban behatol a biológiai szövetekbe. „Az elérhető színek spektrumát is kibővítené” – mutat rá Jan Ellenberg –, ami lehetővé tenné, hogy több fehérjét jelöljünk meg, és követjük őket egyszerre. Ennek a kívánságnak valóra válásához új felfedezésre lehet szükség, mivel Jan úgy véli, hogy a hosszabb hullámhosszon izzó GFP -k készítésének szabványos módja - több aminosavat halmozva fel a fluoroforra - nagyjából kimerült.

Darren a maga részéről azt mondja, hogy a mikroszkópos technikáknak most utol kell érniük: „Jelenleg abban a szakaszban vagyunk, hogy öt színnel zebrahalat készíthetünk, de akkor a legtöbb színnel nem tudnánk megkülönböztetni őket egymástól. a rendelkezésre álló mikroszkópok.”

Ennek ellenére a GFP túlmutat a tudomány területén. Néhány sötétben világító játékban, sötétben világító halakban, háziállatként értékesítik, sőt olyan baktériumokban is, amelyeket genetikailag módosítottak az arzén, a TNT és a nehézfémek kimutatására.

Mindezen előrelépések ellenére azonban a kezdeti rejtély továbbra is megoldatlan: még mindig nem tudjuk, hogy a medúza miért fejlesztette ki azt a képességét, hogy zölden világítson.


28. előadás: Az élet vizualizálása – fluoreszkáló fehérjék

Imperiali professzor a DNS mikrotömbök példájától kezdve a fluoreszkáló fehérjék biológiai kutatásokban való alkalmazására és felhasználására összpontosít.

Oktató: Barbara Imperiali

1. előadás: Welcome Introdu.

2. előadás: Kémiai kötés.

3. előadás: Az Am.

4. előadás: Enzimek és meta.

5. előadás: Szénhidrátok an.

9. előadás: Chromatin Remode.

11. előadás: Sejtek, Az egyszerű.

16. előadás: Rekombináns DNS.

17. előadás: Genomok és DNS.

18. előadás: SNP-k és az emberi .

19. előadás: Cell Traffickin.

20. előadás: Sejtjelzés.

21. előadás: Cell Signaling .

22. előadás: Neuronok, akció.

23. előadás: Sejtciklus és.

24. előadás: Őssejtek, Apo.

27. előadás: Lif.

28. előadás: Az élet vizualizálása.

29. előadás: Sejtképalkotás Te.

32. előadás: Fertőző betegségek.

33. előadás: Baktériumok és An.

34. előadás: Vírusok és Ant.

35. előadás: Reprodukciós Cl.

PROFESSZOR: Oké, rendben, szóval csak nagyon röviden, csak emlékeztetni akartalak, mert a videóhoz tartozik, hogy a biolumineszcencia egy biokémiai reakción alapuló fénykibocsátás. A leggyakoribb a luciferáz enzim, amely a luciferin nevű molekulával reagálva biokémiai átalakuláson megy keresztül, amely ATP -t használ. És ennek az átalakításnak köszönhetően fény sugárzik.

Tehát ezekre nem kell fényt vetni. A fény a biokémiai reakcióból származik. Tehát a vizsgálatok és a sok biológiai munka a luciferin, luciferáz reakción alapul, tehát az ezt végző gombák luciferázt és luciferint is tartalmaznak.

Tehát egy szervezetben transzfektálhat- vagy sejtekben, transzfektálhatja a sejteket luciferázzal, majd amikor készen áll arra, hogy megtegye a lumineszcenciát, a biolumineszcenciát, hozzáadhatja a luciferint exogén módon, és számos vegyész, akik megpróbálnak módosított rendszereket készíteni, amelyek különböző fényenergiával rendelkeznek, és így tovább.

Tehát sok fehérjefejlesztés folyik a luciferin/luciferáz pár alapján. Mindenféle klassz biokémia folyik ott, oké?

Aki bejön, jöhet, és foghat egy fánkot. Áthelyezhetjük őket, vagy kérsz egy fánkot?

PROFESSZOR: Rendben, rendben. Nem arra akartam felhívni a figyelmet- OK, szeretnék röviden visszatérni a tömbökhöz, a DNS-tömbökhöz, mert el akarom magyarázni nektek ennek a technológiának az erejét. Tehát a múltkor tömbökről beszéltünk, amelyek alapvetően nyomtatott elrendezések, és én ... ez egy nagyon apró tömb lesz, hat helygel a tömbön. Tehát ez egy kettő-három tömb.

A biológiában használt anyagok ennél jóval nagyobbak. Láthatja ezeket itt fent – ​​sokkal-sokkal több foltot, és ez csak akkora, mint egy tárgylemez, és ezeken a helyeken különböző DNS-szekvenciák lennének.

Tehát specifikus DNS-szekvenciákról van szó, és a tömbre nyomtatják őket – eredetileg csak nyomtatókkal készült. Most már vannak technológiai módszerek ennek kezelésére, és általában szilícium vagy üveg tárgylemezeken vannak. Tehát sok mérnöki munka történt az eredeti tömbökben, hogy ezeket a valóban tömör DNS -eloszlásokat el lehessen készíteni.

És ezeket nevezzük címzett tömböknek. Tudjuk, mi van az egyes oldalakon. Tisztában vagyunk az egyes helyszínek szekvenciáival, és nagyon jó kémia létezik, amely lehetővé tette volna ezeknek a tömböknek a elhelyezését. Tehát ezek a tömbök a DNS komplementer darabjainak vizsgálatára szolgálnak.

Tegyük fel, hogy van egy GHIJ, amely potenciálisan a genomiális DNS-ből származik, és kiegészítik- mindegyik kiegészíti a JK egyik helyét- kiegészíti a tömb egyik helyét, de a DNS a szűrést kifejezetten fluorofórral jelölték, rendben?

Tehát ezek fluoroforosak lennének, és a tömbök segítségével gyorsan szűrheti vagy a genomiális DNS-t, vagy valójában sokkal hasznosabb, mint most tudni fogja, a transzkriptomot, tehát a hírvivő RNS-eket, és emlékeztetni fogom. Ön a technológiáról, amellyel a hírvivő RNS-eket kiveszi a sejtekből, majd megfelelő másolatot készít belőlük a tömbökön található DNS-t kiegészítő DNS-ből. Tehát nézzük meg a következő diát, amely leírja a kísérletet.

Tegyük fel, hogy olyan sejtpopulációkat szeretne szűrni, ahol az egyik sejt rákos, a másik egészséges. Összegyűjtöd a lizátumot azokból a sejtekből. A hírvivő RNS -t feltehetően egy címke vagy a hírvivő RNS olyan jellemzője alapján gyűjtené, amely csak a hírvivő számára közös.

Mi lenne az? Mi lenne a közös az érett hírvivő RNS -ben, amely lehetővé tenné, hogy csak a hírvivő RNS -t rögzítse, nem az összes többi RNS -t, nem a DNS -t. Bárki? Igen?

PROFESSZOR: A poli-A farok. Tehát egy megfelelő gyantával, például egy poli-T támogatással rögzítheti az összeset, majd minden esetben vegye a hírvivő RNS gyűjteményt, majd csak annyit kell tennie, hogy komplementer DNS -szekvencia.

DNS -szinten sokkal boldogabbak vagyunk a szűrések, mert az RNS kevésbé stabil. Tehát nagyon praktikus elvégezni ezt az átalakítást, és a vírus enzimet, a reverz transzkriptázt használja. Ez egy olyan enzim, amely a retrovírusokból származik, amelyekre példa a HIV retrovírus, amelyről az óra utolsó hetében fogunk beszélni. Így megtudhatja, hogy a fordított transzkriptáz hova illeszkedik a HIV vírus életciklusában.

Majd miután összegyűjtötte az RNS-sel komplementer DNS-t az egyes sejttípusokból, egyedileg jelöli meg őket, például zöld fluoroforokkal vagy vörös fluoroforokkal. Ez egyfajta globális reakció, amelyet csak beilleszt- kémiailag kapcsolja össze a fluorofort minden egyes DNS-halmazhoz.

És akkor alapvetően mindent összevon, és megnézi, hogyan világítanak a chipek, a tömbök. Tehát a tipikus kísérlete mindenhol ott lenne, ahol van valami, aminek vörös fluorofórja kötődhet egy egyedi webhelyhez. Minden, ami zöld fluoroforral rendelkezik, kötődhet a tömb egy másik egyedi helyéhez.

És ha mindkét típusú DNS ugyanahhoz a helyhez kötődik, az sárga színben jelenik meg. Ha senki sem köt, akkor üres foltként jelenne meg. Így ezeket a gyűjteményeket megszerezheti, ahol meglehetősen könnyen több ezer sorozatot nézhet meg, hogy megtudja, kiegészítik -e egymást. Ez benne van a tömbödön.

Mindenhol sárgát lát, a rákos sejtet és az egészséges sejtet, amelyek egyformán kötő jellegűek, tehát nincs semmi betegség. Szóval ez egy érdekes funkció, mert mondhatjuk, hogy ezek egyike sem problémás szegmens, de akkor nagyon tisztán látunk olyan foltokat, amelyek egyértelműen pirosak.

Tehát az üveg- vagy szilícium -chipen található DNS -szekvenciák kiegészítik azokat a szekvenciákat, amelyek egyedülállóak a rák genomjában, az adott lázból származó rákos sejtvonal mRNS -ében. Szóval elég menő.

Nem tudom, hogy valamelyikőtök megnyerte-e ezt a linket, de alapvetően ez a fickó egy padon ül, és egy kísérletet végez, ahol ezreket képes elvégezni- ezer vagy ezer kísérletnek felel meg egyetlen génchip használatával hogy elvégezze a szondázást. Más esetekben zöld foltokat fog látni, ami azt jelenti, hogy kizárólag az egészséges sejtekből származnak.

Tehát valóban ezeket akarja kihallgatni, és ahol fekete, ott semmi sem kötelező, tehát kevésbé fontos. Így lehetővé teszi, hogy több ezer és ezer különböző szekvenciából álló rácsból kiválassza a gyanús személyeket egy betegséggel kapcsolatos helyzetben.

Van ennek értelme? Elég klassz technológia. Az eredeti chipeket úgy hívták -- azt hiszem, az Affymetrixből származtak, az Affy chipekből, és nagyon széles körben használják a mai napig, és vannak különféle változatok, de szerintem az egyik leghasznosabb és Emlékeztetni fog néhány dologra, amiről az osztályban beszéltünk, hogy különböző típusú, történelmű sejteket tudsz növeszteni.

Például gyűjti a hírvivő RNS -t, mert ne feledje, az átírás sokkal érdekesebb számunkra, mint a genom. A chipeknek sokkal nagyobbaknak kell lenniük ahhoz, hogy az összes genomot átvizsgálják, majd reverz transzkriptázt használnak az RNS komplementer DNS -jének előállításához, mert ez stabilabb, jobban kezelhető, majd felviszünk egy fluorofór címkét, keverj össze mindent, és nézd meg, mit kapsz.

Szóval ezek a jelöltjeim. Tehát, ha volt egy kísérlete, hadd gondolkozzam el- mutassam be, mire képesek a tömbök, de győződjünk meg arról, hogy tudjuk, mit nem tudnak, mert mindig fontos, amikor valaki azt mondja, én ezt a technológiát kaptam. Meg fogja oldani a világ összes problémáját. Dobja el, vagy a főzőpoharat és a kémcsöveket. Csak nem kell semmit sem tennie, és mindent tömbökkel megoldhat.

Tegyük fel, hogy olyan helyzetben van, hogy bizonyos esetekben, bár a gének hibásak lehetnek, a hírvivő továbbra is előáll, OK? Tehát valami baj van, de a hírvivő RNS -t készíted. Tehát továbbra is normálisan jelenne meg a chipen, de a génhiba megakadályozza a fehérjékké történő transzlációt.

Tehát megkapja a gént, de nem tudja lefordítani, tehát úgy néz ki, mint egy normális gén, de benne van a fordításban a sávból- a hírvivő RNS-ből a fehérjébe, ahol a dolgok rosszul mennek. Mit fog látni a tömbön?

Egészségesnek fog kinézni? Úgy néz ki, hogy nem egészséges? Mi lesz az eredmény? Használhatok tömböt, DNS tömböt ehhez a kísérlethez? Igen? Mit gondolsz?

PROFESSZOR: Igen, igen. Csak úgy fog kinézni, hogy minden a chiphez kötődik. Nem lesz informatív. Tehát ebben az esetben nagyon különböző kísérleteket kell végeznie, amelyek fehérje szinten vannak, rendben? Tehát szeretném, ha emlékezne rá, hogy ezek nagyon jók a genomi szekvencia, a hírvivő RNS szekvencia megszerzéséhez.

De ha van például egy előállított fehérje, és van egy probléma, mondjuk egy kináz által végzett foszforilációval, amely kritikus lehet a sejt működéséhez, akkor ezt nem fogja látni a tömbben. Ez nem lesz látható. Különféle típusú kísérleteket kell végeznie, például foszfoproteinekkel, specifikus antitestekkel, hogy elmondja, hogy rendellenesség van ezekben a rendszerekben.

Tehát mindig, amikor valaki azt mondja neked, megvan ez a nagyszerű kísérlet, azt mondod, mit tehet? Ez fantasztikus, de mit nem tehet? Rendben, emiatt aggódnom kell, rendben?

Rendben, amit eddig láttunk, az az, hogy számos fluoreszcens eszközt láttunk, például a sejtmag megjelölésére, vagy az eredeti etidium-bromid típusú foltok, amelyek beépülnek a DNS-be, és fluoreszcens jelet adnak, amely gélen látható.

Láttuk az etídium -bromid evolúcióját kevésbé mérgező anyagokká, például a DAPI -festékké. Tehát az etídium-bromid interkalálódik- etídium- sajnálom, a DAPI kötődik a kisebb barázdához. És legutóbb láttunk képeket erről.

Az egyik fontos különbség az ilyen típusú festékekkel az, hogy a DAPI az úgynevezett szupravitális festék, ami azt jelenti, hogy használhatja ezt a festéket és megfigyelheti az élő sejteket. A szupravitális tehát olyan kísérletekhez kapcsolódik, amelyeket a még élő sejtek megfigyelésével végezhet.

Az etidium-bromid nem olyan festék, és az antitestek sem, mert az etidium-bromid mérgező, tehát bár az etidium-bromid bejut a sejtekbe, valójában itt kellene lennie a H-nak, mert az az én nyelvemen etil-bromid lenne.

Tehát az etídium -bromidban ott van a H. Ezt nem használhatja. Nem szupravitális festék, mert mérgező a sejtekre, mivel beépül a DNS-be, és megzavarja a replikációt, tehát ez nem szupravitalis, tehát a DAPI az.

Ez a fickó nem az, és az antitestek, amelyekről a múltkor tanultunk egy kicsit, ezek az én leírásomból származnak, egyszerűen reagensek a biológiai rendszerek összetevőinek felismerésére, leggyakrabban a fehérjékre, és mostanra egyre jobban megyünk az antitestek előállításához. szénhidrátokhoz vagy glikánokhoz.

Az antitestek szupravitálisak vagy nem, és miért – ha nem, akkor miért? Használhatom ezt egy sejten, és követhetek egy élő sejtet antitesttel? Igen? Carmen?

KÖZÖNSÉG: Nem tűnik túl valószínűnek, hogy az antitestek lehetővé teszik a fehérjék számára, hogy bármit is tegyenek.

KÖZÖSSÉG: Szóval azt hiszem, hogy a sejtek meghalnak.

PROFESSZOR: Tehát helyes- nem szupravitálisak. Szerinted mi történne, ha antitestet adnék az élő sejthez? Foltos lehet- elfesthet valamit a sejt felszínén, de- ahogy mondod- zavarhatja a sejt működését.

Tegyük fel, hogy ellenanyagom van az epidermális növekedési faktor receptorral szemben. Ez megváltoztatja a tulajdonságokat. Tehát ebben a tekintetben igazad van. Mi a helyzet a sejteken belüli célokkal? Bejönnek az antitestek? Igen?

PROFESSZOR: Igen. Igen. Igen, ez egy nagy fal, őszintén. Ez egy áthatolhatatlan akadály a bejutáshoz. Tehát valójában csak befoltosodhat- csak az úgynevezett fix sejtekben figyelhet meg. És amikor egy sejtet rögzített sejtnek nevezünk, akkor valójában azt értjük, hogy összetörtük, mert azt csináltuk, hogy metanollal kezeltük a sejtpopulációt, ami lyukakat szúr ki a sejtmembránokon.

Javítva vannak. Statikusak a dián. Nem fognak többé mozogni, és megfestheti az antitesteket. Elmondhatja, hogy mi történt abban a pillanatban- mi történt abban a pillanatban, amikor a sejt elhalt, ha akarja, mi történt, milyen fehérjék voltak ott.

De nem figyelheti tovább az előrehaladást, mert akkor a sejtek már nem életképesek, rendben? Tehát egyik megközelítés sem rendkívül fontos, de különböző okok miatt. Az egyik a toxicitás. A másik szintén a toxicitás, ahogy Carmen rámutatott, de ez is probléma a membránáteresztő képességgel.

Tehát az előadás további részében arról fogunk beszélni, hogyan lehet megkerülni ezt az áthatolhatatlan problémát, és ezt-- és a zöld fluoreszcens fehérje felfedezését, és valójában leginkább a GFP-ről és annak közeli testvéreiről van szó. ezek különböző színűek lehetnek.

Amin keresztül szeretném végigvezetni Önt, az a fehérje felfedezése, és nagyon szeretném lenyűgözni, hogyan zajlik a tudomány vicces, kis lépésekben már korán. Soha nem lehetett előre megjósolni, hogy egy medúza Seattle partjainál forradalmasítja a biológiát, a biokémiát, az élettudományokat, igaz?

Ki gondolta volna ezt valaha? És ezért, tudod, ők, kollégák, mi és kollégáink annyira izgatottak az alapvető tudományok iránt, ahol nem egészen tudod, hogy hová mész, de valami klassz dolgon dolgozol, és akkor az előkészített elme megy , Azta! Ez érdekes. Ezt használhatnám erre a problémára.

Shimamura tehát japán biokémikus volt, akit lenyűgöztek a medúzák és azok biolumineszcenciája, és évekig dolgozott, éveken át rabszolgaként. Nyilvánvalóan családjával a Puget Sound -i kis szigetekre menne, és a gyerekei egész nap medúzákat gyűjtenének, mert észrevett bizonyos dolgokat a medúzákkal kapcsolatban, amelyek meglehetősen érdekesek voltak tulajdonságaik tekintetében.

És a legfontosabb dolog, amit megfigyeltünk, az volt, hogy a medúzákban biolumineszcens fehérje található, amelyet aequorin néven ismernek. Tehát ez a fajta lumineszcencia, amit az imént leírtunk, de sötétben volt egy fluoreszcens faj is, és kiderült, hogy az aequorin fényenergiája valóban fel tudja gerjeszteni a zöld fluoreszkáló fehérje flooforját, és akkor kibocsátja a fényt a zöld hullámhosszának.

Tehát valójában egy pár fehérje volt, az aequorin és a második dolog, ami csak a zöld fluoreszcens fehérje volt, és ami ebben a fehérjében lenyűgöző volt, hogy egyre több munkát végeztek, hogy úgy tűnt, nincs szükségük semmilyen adalékanyagra.

Tehát a biolumineszcenciához hozzá kell adni az ATP -t, és hozzá kell adni a luciferint. A fluoreszcenciához hozzá kell adni valamit. Ami egyedülálló volt a zöld fluoreszcens fehérjében, az az, hogy nem kellett hozzá semmit. Most kaptad meg a fehérjét, és fluoreszkált.

Szóval, amiről szeretnék beszélni, az a fluoreszcens molekuláris alapja, és beszélni fogunk a fehérjefejlesztésről is, amelyet szisztematikusan végeztek, hogy ez egyre hasznosabb reagenssé váljon. Tehát Shimamura volt az első személy.

Gyermekei annyi medúzát gyűjtöttek össze, hogy a hagyományos, régi iskola biokémiai módszereivel kinyerhessék a zöld fluoreszkáló fehérjét, és kristályokat, fehérjekristályokat nevelhessenek. Találd ki? Világos zöldek, és képesek vagyunk megoldani a szerkezetet.

Miután megvolt a szerkezet, nagyjából tudták, mi történik a medúzával, és képesek voltak felismerni a zöld fluoreszcens fehérje szekvenciájának egy bizonyos részét, amely végül a manapság látható fluorofor előfutára lett. értjük.

Eredetileg a fehérje nem volt monomer. Később beszélek erről egy kicsit. A technológia szempontjából sokkal praktikusabb, ha ez a fehérje monomore, nem pedig dimer vagy tetramer. Ez bonyolítja a kísérleteket, de megmutatok egy nagyon egyszerű trükköt, amellyel ezt kijavították.

És így a többi ember, aki megosztotta a Nobel-díjat Shimamurával, aki mellesleg alig pár hete hunyt el, valójában azonban csodálatos idős korban. Biztosan csak a medúza utáni ásás segített neki ennyi ideig élni.

Ott volt Martin Chalfie is a Columbiában, aki bebizonyította, hogy a zöld fluoreszcens fehérje génje mindenféle állatba, szervezetbe, C elegans baktériumba bevihető, és ezek fluoreszkálnak. És ebben az egész történetben igazán fontos szereplő volt Roger Tsien, aki nagyon fiatalon halt meg agyvérzésben, aki a kémikus-biokémikus, aki összerakta a darabokat, azt mondta: ha ez a GFP, akkor sok mindenre használhatjuk. Tehát valóban fejlettebbé tette az alkalmazások technológiáit.

Tehát a fehérje expressziója lehet- rájöttek, hogy elég korán be lehet programozni egy fehérjébe úgy, hogy a zöld fluoreszcens fehérje DNS-e ragaszkodik egy kedvenc fehérjéhez. Akkor a DNS -t át kell írni, le kell fordítani a sejtben, majd a kedvenc fehérje a sejtben zölden fluoreszkál, mert konstrukcióként kapcsolódik a többi fehérjéhez.

Tehát mindezek a dolgok gyorsan aktiválódtak. Ezt meg lehetne tenni minden szervezetben, eukariótában, prokariótában. Meglehetősen nem mérgező, így egy csomó GFP expressziója egy sejtben nem öli meg. Ez valahogy praktikus.

Tehát ez egy rendkívül létfontosságú rendszer, és mindenféle szövetben látható. Tehát itt megmutatom néhány alapvető eredményt, először is a szerkezetet, amelyről beszélni fogunk, majd Chalfie képes volt a DNS -t fehérjékbe és baktériumokba, valamint a megjelölt fehérjékbe helyezni a C elegansban.

És Chalfie története vicces. Egyike azoknak a srácoknak, akiknek nem feltétlenül volt minden szükséges felszerelése, de tudta, hogy ez igazán izgalmas, és szüksége van egy fluoreszcens mikroszkópra. Felhívná tehát az összes céget, akik mikroszkópokat árultak, és mondjuk tényleg gondolkodom ezen a fluoreszkáló mikroszkóp megvásárlásán. Ez konkrétan az lenne- ezek néhány száz nagyságúak, tudod, ezek nem olcsók.

És rábeszéli a céget, hogy helyezzenek el egy mikroszkópot a laborjában egy hónapra bemutatóként. Tudod, hogy azt mondod az autókereskedőnek, hogy autót szeretnél venni, majd egy hónapig körbevezeted a Ferrarit, majd azt mondod, hogy ez nekem nem megy. Összegyűjtötte tehát az összes korai adatát az Olympustól, a Leicától és számos más helyről kölcsönadott mikroszkópokról. Szóval ez egy vicces, vicces fordulat.

Rendben, szóval a fluorofor... rendben, így a DNS-ből fehérjeszekvenciává válhatnak. Aztán megnézhették a szerkezetet, és láthatták, hogy az a hely a fehérjeszekvenciában, amely szerin, tirozin, glicin lett. Szóval tessék- szerin, tirozin. Ezt felismered. Ez az egyik aromás gyűrűvel rendelkezik, a glicin pedig az, amelyikben nincs szubsztituens.

Számos szervezetben gyakori volt, főleg vízi szervezetekben, amelyek fluoreszkálnak, és úgy tűnik, hogy a GFP-ben a fluorofor eredete, így a vegyészek munkához láttak, és tudod, mit csinálnak a kémikusok, elkezdenek nyilakat rajzolni, kötéseket összekapcsolni és kitalálni. hogyan tudunk elmenni valamitől, ami alapvetően halott, és egyáltalán nincs fluoreszcenciája valami fluoreszkáló dolognak.

Így a szerkezetből és a mechanizmus kidolgozásából alapvetően azt találták, hogy ez a kis darab, ez a tripeptid a DNS primer szekvencia teljes szerkezetében, képes volt ciklizálni a nitrogénen keresztül, megtámadva azt a szenet, majd eliminálni, majd ott. oxigénfüggő oxidáció volt, hogy ezt a szerkezetet megkapja.

Tehát, ha ezt nézi, akkor is láthatja a szerint. Tudja, hogy ez tirozin volt, de már nem úgy néz ki, és kiderült, hogy a glicin hihetetlenül fontos volt. Nem úgy tűnik, mintha benne lenne a kromoforban, de ha egy glicin van egy sorrendben, lehetővé teszi néhány vicces fordulat elvégzését, mert nincsenek helyettesítői.

Tehát megengedte, hogy ez a hurok kialakuljon. Ha ez a hurok létrejön, kémia léphet fel. Ha a glicin nem lenne ott, akkor a dolgok nem lennének ideális helyzetben a fluorofór kialakulásához. A kettős kötés oxidációja oxigénfüggő.

Tehát bizonyos esetekben a fluorofór kissé lassabban érik. Tehát a nem fluoreszkáló szabad állapotból meglehetősen lassan menne a fluoreszkáló állapotba, ha visszatartaná az oxigént.

Tehát sok mérnöki munkát végeztek az érlelési idő javítása, a fotófizika javítása érdekében. Nagyon klassz fotofizikai kísérleteket végeztek, de ez az alapja, és ennek a fluorofórnak a kibocsátása, szinte felismerhető, hogy ez egy fluorofor, mert sok benne van a konjugációnak a szerves kémiában- egy kettős kötés, egy másik kettős kötés ragadt erre a gyűrűre több kettős kötéssel.

És ugyanabban az időben bocsát ki- hasonló hullámhosszon, mint a fluorofór fluoroszcein, így az emberek boldogok voltak, mert a mikroszkópjukon lévő összes szűrő a megfelelő volt. Ha csak a fluoroscein szűrőket használná, kapna egy GFPC-t. Szóval ez tényleg a mennyben készült azoknak a srácoknak.

Rendben, akkor vessünk egy pillantást erre. Íme az eredeti kristályosított szerkezet huzaldiagramja. Elhelyeztem oda egy szalagot. Megszabadulok az összes oldallánctól, így látod ezt a gyönyörű dimer szerkezetet.

Dobjuk el az egyik dimert, és elkezdheti nézni. Van benne valami furcsa, és ahogy közelebb ért, elkezdheti látni a szerkezetet.

Van egy ilyen szál. Ez csak a gerinc nyoma, de ott van a fluorofor szerkezete. Itt van a fluorofor a térkitöltéssel, és szerintem valami hűvös, ha a GFP -t körbeforgatod, olyan, mint egy hordó, és úgy néz ki, mint egy madár a ketrecben, mert ott van ketrecben.

És hogy őszinte legyek, ez a szerkezet. Ez nem csak a milofór szerkezete. Az a tény, hogy a fluorofor egyfajta hidrofób környezetben van, ami miatt fluoreszkál. Bemehetnék a laboratóriumba, elkészíthetném azt a floofort, és beletenném egy főzőpohárba metanolba, és nem látnál semmit.

Csak abban a környezetben jön létre a GFP molekula, tehát lenyűgöző. A GFP szerkezete létrehozza a ciklikus formát, és megteremti a környezetet a jó fluoreszcenciához. Tehát rengeteg állata van, amelyeket GFP-vel jelöltek. Mint láthatta, az egerünket többször is felcímkézték.

Ez volt az első GFP nyúl. Alba néven ismerték. Még saját neve is volt, de van hínár, zebrahal és egerek egy betűből, C elegans, a híres, a légy. Mi más? Nem is tudom, mik ezek a dolgok, de Purkinje sejtek stb.

Mindegy, tehát ez megmutatja az eszköz egyetemességét. Röviden megemlítve a dimer problémát, az emberek a gyémánt szerkezetét nézték a kristályszerkezetből, és azt találták, hogy a GFP két monomerje között ragadós felület van, amely ösztönzi ezt a negyedéves szerkezetet.

Így egyszerűen megváltoztattak két alanint, amelyek közvetlenül a dimer felületén ültek, az egyik az egyik monomerből, a másik a másikból, és ragadós foltot hoztak létre. Kicsit hasonlít a hemoglobinra, ha emlékszel, a sarlósejtes hemoglobinra.

Licinre változtatták őket, és [HALLATLAN] megoldotta, hogy csak monomer fehérjét tartalmaz, mert amikor sok kísérletet végez a GFP -vel, nem akarja, hogy a GFP véletlenszerűen dimerizálódjon, mert megváltoztatja a hozzá kapcsolódó fehérje biológiáját. Tehát ez a nagyon-nagyon könnyű szerkezetvezérelt tervezés tökéletes volt.

Rendben, akkor vessünk egy pillantást azokra a korai dolgokra, amelyeket most meg lehetne tenni. Mindezt természetesnek vesszük, de a GFP riportergénként használható számos dologra a sejtrendszerekben. Például, ha egy szabályozó szekvenciát szeretne tanulmányozni, hogy megtudja, jól működik-e ez a promóter, akkor a GFP gén elejére helyezheti, majd megnézheti, hogy a promóter bizonyos körülmények között működik-e, akkor a GFP létrejön. . A sejtek zöldre nőnek.

És ez egy szép változata egy luciferáz-alapú rendszernek vagy egy LacZ-alapú rendszernek, ahol ténylegesen kezelni és javítani kell a dolgokat a LacZ-kísérletek elvégzése érdekében. Tehát itt egy igazán szép példa a C elegansra.

Amit a GF előtt tehet-valóban van-olyan, mint az ADBC-tudod, minden ellen a 0 év előtt és a 0 év után. A biológiai világ a GFP előtt és a GFP után, őszintén szólva, a hatása a rendszer.

Tehát itt van egy C elegans. Mint tudják, minden idegsejtnek neve van, és sok C elegans biológus nagyon jól ismeri a C elegans egyetlen sejtjét, különösen az idegsejteket. Ez tehát az érintésérzékelők listája.

Lehet ellenanyagod ezekkel szemben, és így csinálhatsz némi antitestfestést, de az antitestfestés, ne feledd, meg kell javítanunk a férgeket. Ezt nem szeretik. Szó szerint rögzíted őket, és megfested az antitestet, hogy bejuss a C elegansba, és látni fogod, hogy az antitest felgyújtja a fehérjéket.

Csinálhat béta-gal tevékenységet, ugyanazt, de mindkét esetben halott C elegans. Javítva vannak. A helyükön vannak. Nem lehet megfigyelni őket, ahogy haladnak előre. Ehelyett nézze meg, hogy a GFP -vel kapott képeket, ahol teljesen ki tudja választani az összes érintésérzékelőt.

És ez egy olyan helyzet, amikor az ezekben a sejtekben lévő fontos fehérjét, a MEC-17-et együtt expresszálják a GFP-vel, és láthatja ezt a gyönyörű képet, és a férgek még mindig élnek. Teljesen figyelhetnéd, mi történik velük, és ő csak azt akarja, hogy tudd, él, jól van, és rugdos.

Rendben, most haladni kell. Tehát egy zöld fehérje nem történelem. Tehát azonnal, a GFP felépítésének azonosításával, nagyon gyorsan visszamegyek, hogy megnézzem a struktúra képét az Ön számára. Bocsánat ezért oda-vissza.

Rendben, a kémikusok rájönnek, hogy ha ezt a tirozint lecserélik néhány olyan aminosavra, amelyek kicsit hasonlítanak hozzá, például fenilalaninra, triptofánra és hisztidinre, akkor megváltoztathatják ennek a szerkezetnek a fotofizikáját, mert ha triptofánt teszünk bele, akkor még több kettős kötvény. Ha fenilalanint tesz oda, akkor az OH eltűnik.

Tehát valóban vannak lehetőségek, és ezt a vegyészek mondják: meg tudom nézni ezt a fehérjeszerkezetet, és tudom, hogy egyetlen dolog, amin változtatni tudok, hogy megváltoztatom ezt az aminosavat a DNS szintjén. Tehát lecserélem a tirozin kodonját a triptofán, a fenilalanin és a hisztidin kodonjaira, majd megnézem, hogy néz ki a fluoreszkáló fehérjem, OK? Ennek van értelme?

Tehát ez volt az egyetlen dolog, ami nyilvánvaló. Ezt meg tudom oldani. Tehát amit csináltak, elkészítették a GFP sorozatot, és transzfektálták a sejteket, és láthatták, hogy amikor különböző maradékokat, például a tirozint triptofánra, a tirozint hisztidinre cserélték.

Itt van egy kis eltérés, és ne aggódjon emiatt egy percig sem. Képesek voltak olyan baktériumokat létrehozni, amelyeket a mutált GFP -kkel transzfektáltak, hogy különböző színű baktériumokat kapjanak.

Tehát a kérdésem az Önhöz az, hogy ha ezeket nézi, akkor ez lett volna az eredeti GFP, kivéve, ha egy kis helyettesítéssel kissé világosabbá teszi, és ezek közül melyik bocsát ki a legrövidebb hullámhosszon. Tehát csak nézd meg a színeket, amely a legrövidebb hullámhossz, ez az a baktérium, amely a legrövidebb hullámhosszon kibocsátó fehérjét fejezi ki.

Mindig kap egy képet az elektromágneses spektrumról. Igen, odakint.

PROFESSZOR: Igen, pontosan a kék. Szóval megnézheted a spektrumot, és azt mondod: Rendben, kék van itt lent. Ott az a cián. Amolyan kék zöld, majd a sárgább felé haladok.

Tehát kiválaszthatja, és azt mondhatja, hogy ez a legalacsonyabb energia. Ez a legrövidebb hullámhossz -kibocsátás, a legnagyobb energiakibocsátás. Rendben, rendben, és ezek voltak azok az eltérések, amelyeket az imént leírtam, miközben visszatértem a képhez.

Tehát készíthet egy kéket hisztidinnel. Készíthetsz egy ciánt triptofánnal. A zöldet meg lehet őrizni tirozinnal, de a szerint treoninra cserélni csak a fotofizika javítása érdekében, hosszú történet. Nem fogok... Szívesen csevegek róla.

És valójában volt egy okos, ahol a fehérjét nem igazán lehetett sárgássá tenni, de ha a tirozint a tirozinnal és a GFP kromofórral a közelben helyezte el, akkor egészen a sárga flouorforig is eljuthat.

És ez elvileg mindenkit igazán izgalomba hoz. Mindig ez a helyzet a fehérjemérnökségnél, amikor készítesz valamit, és ez óriási javulás, és akkor mindenki azt mondja, hát mi más, tudod? Mi a következő lépés? Szükségünk van vörös festékekre. Mindenféle színezékre szükségünk van.

Így a csapatok visszamentek az óceánokhoz, és valójában a fluoreszkáló szín alapján gyűjtöttek élőlényeket, ami jó módja annak, hogy mintát vegyenek. És valójában végül sikerült felfedeznünk egy vörös fluoreszcens fehérjét a Discosoma korallból, az eredeti fehérjét, a DS red-t, és ha figyelmesen megnézzük, nagyon hasonlít a GFP-re.

Ott a tirozin, az a vicces gyűrű. Van ott kettős kötés, de van egy további kettős kötés lejjebb a szekvenciában, amely kiterjeszti azt, amit kromofórnak nevezünk. És ha kiterjeszti a kromofort, akkor nagyobb valószínűséggel hosszabb hullámhosszra költözik, és így kapták a pirosat, majd később egy csomó mérnöki tevékenységet, és megkapták az úgynevezett gyümölcsöket, amelyek mindenféle hullámhosszon kibocsátanak.

Ennek nagy részét nem racionálisan tették, mert a természetbe mentek. Megtudták, mit tett a természet. Ide jutottak, majd elvégeztek egy génkeverés néven ismert eljárást, ahol a gének egyes részeit összekeverték és összeillesztették, hogy megkapják a teljes színspektrumot.

Nem mindegyik mesés fluorofor. Van néhány problémájuk. Könnyen kifehérednek, és így tovább, de ennek ellenére ez egy igazán csodálatos eredmény. Rendben, és lehetővé teszik, hogy művészeti alkotásokat végezzen fluoreszkáló fehérjékkel a baktériumokkal, tehát csak lefesti a képet, és megvárja, amíg a baktériumok elszaporodnak, és meglesznek ezek a színek.

Tehát a fluoreszcens fehérjék eredetileg nagyon korlátozottak voltak, eredetileg csak zöldek, majd kék-zöldek és zöldessárgák, de most a rendelkezésre álló palettával mindenféle organellum különböző típusú színekkel színezhető, igaz?

Rendben, akkor most vegyünk néhány dolgot. Amikor megnyitottuk ezt az osztályt, megmutattunk nektek egy csomó ilyen képet, mert azt akartuk, hogy maradjatok nálunk 7016 -ban, hogy megnézzétek a menő dolgokat, amelyeket látni fogtok, és nagyjából ezeket neveztük szemcukorkának.

Jól néznek ki, de hogyan készítettük el? És most, a GFP és az RFP és így tovább ismeretében, azt mondhatja: OK, értem, mi ez a kísérlet, és biztosan láthatja, hogy ez egy rendkívül létfontosságú technika.

Szóval azt szeretném kérdezni, hogy mit nézünk? Mi jelzi nekünk ezt a gyönyörű képet? Tehát valahogy le lehet menni, és van egy csomó lehetőség, de nyilvánvalóan helytelen minden, ahol azt gondolja, hogy a DNS -t fluoreszkáló fehérjével címkézi. Fehérjeszinten címkézünk.

A DNS -t a fluoreszkáló fehérje kifejezésére készítjük, de valójában egy fehérjét jelölünk a DNS -sel szemben. Tehát A és B biztosan kint van, de ahogy átmegyünk rajtuk, láthatjuk, hogy a kromatin piros, a tubulin pedig zöld, szóval az eredmény az lenne, hopp, mit figyelünk... azt figyeljük meg, hogy a hisztonok, amelyek a kromatinhoz kapcsolódó fehérjék, egy vörös fehérjével vannak megjelölve.

És ezt ott is láthatja. Ezek a kromatidák, és a tubulin, ezek a zöld szálak GFP -hez kapcsolódnak. Tehát C lenne a helyes válasz.

És van még egy ilyen sejtosztódási kép. Ismételten ugyanez a gondolat, de szerintem nagyon jó itt, ahogy a szó szoros értelmében is látszik, szeretem ezt a képet, mert ott van ez a szegény kromoszóma. Úgy tűnik, nem fér össze a csapat.

Ott lóg, és végül, közvetlenül a sejtosztódás előtt úgy tűnik, hogy minden rendben van, és megtörténik a sejtosztódás.

Ha most erre gondol, az a képesség, hogy ezt a cuccot működés közben nézheti, valóban elképesztő. Ez egy másik volt. Ez a sejtvonalak halmaza, ahol a sejtciklusban lévő fehérjék meg vannak jelölve.

Kérdése volt a harmadik vizsgán a fehérjék felhalmozódásáról és felhalmozódásáról – és a sejtciklus bizonyos szakaszaiban való eltűnéséről. Tehát gyakran egy fehérje lebomlása akkor következik be, amikor egy fehérjét ubiquitinnel jelölnek meg egy ubiquitin ligáz, majd lebomlásra szánják.

Tehát azok a fehérjék, amelyeket a sejtciklus fázisaiban felnőnek, eltűnnek az ubiquitin proteaszóma rendszer miatt. Tehát ezekben a sejtekben bizonyos fehérjéket megjelöltek, és itt láthatja a fázisokat – a sejtciklus összetevőit, ahogy a fehérjék jönnek és mennek át a sejtosztódáson, és szó szerint megfigyelheti, hogy a sejtciklusban hol található az egyes fehérjék.

Azt hiszem, miért olyan lenyűgöző ez a terápiás fejlesztésben az, hogy szó szerint létezhetnek olyan gyógyszerek, amelyek hatással lehetnek a sejtciklus egyes aspektusaira, és megnézheti, hogy azok valós időben befolyásolják a képalkotást, amelyet ezen a képernyőn a pirossal és a zöld, mert ha a sejtciklus egy bizonyos szakaszában leáll, a sejt elakad egy adott színnél, és még azt is tudná, hogy a fázist, a sejtciklus mely részeit érinti.

Szóval szerintem ez egy igazán lebilincselő módja annak, hogy elgondolkodj azon, hogy mit lehet kezdeni ezekkel a fehérjékkel, mert valós időben láthatod a dolgokat, a sejtrendszerek dinamikáját. És azt hiszem, ó, és néhány perccel korábban befejezem, de kétségbeesetten kerestem egy fluoreszkáló pulykát, de nem találtam.

Így mentem ezzel a világos húr pulyka és fluoreszkáló színekkel. Úgy tűnt, megfelel a számlának. Rendben, kérem, segítsen nekünk a bagel befejezésében. Győződjön meg róla, hogy ti odaát megkapjátok őket, és pihenjetek jól, és hétfőre visszaküldöm Martin professzornak, ami a képalkotás folytatása lesz, rendben.


Hogyan oszlik el a zöld fluoreszkáló fehérje a szervezetben? - Biológia

A zöld fluoreszcens fehérje felfedezése az 1960 -as évek elején végül új korszakot hirdetett a sejtbiológiában, lehetővé téve a kutatók számára, hogy molekuláris klónozási módszereket alkalmazzanak, és a fluorofór egységet sokféle fehérje- és enzimcélhoz olvasztják össze, hogy figyelemmel kísérjék az élő rendszerek sejtfolyamatait. optikai mikroszkópia és a hozzá kapcsolódó módszertan segítségével.A széles látómezős fluoreszcencia és a konfokális mikroszkópia legújabb technikai vívmányaival párosítva, beleértve az ultragyors, alacsony fényszintű digitális fényképezőgépeket és a többkövetős lézeres vezérlőrendszereket, a zöld fluoreszcens fehérje és színeltolásos genetikai származékai felbecsülhetetlen értékű szolgálatot tesznek sok ezer élő sejtes képalkotó kísérletben. .

1.ábra - Fluoreszcens fehérjecímkék élő sejtekben

Osamu Shimomura és Frank Johnson, a Washingtoni Egyetem pénteki kikötői laboratóriumában dolgoztak 1961-ben, először kalciumfüggő biolumineszcens fehérjét izoláltak a Aequorea victoria medúza, amit el is neveztek aequorin. Az izolálási eljárás során egy második fehérjét figyeltek meg, amely nem tartalmazta az aekorin kék fényt kibocsátó biolumineszcens tulajdonságait, de ultraibolya fénnyel megvilágítva képes volt zöld fluoreszcenciát előállítani. Ennek a tulajdonságnak köszönhetően a fehérjét végül keresztény névre keresztelték zöld fluoreszkáló fehérje (GFP). A következő két évtized során a kutatók megállapították, hogy az aequorin és a zöld fluoreszcens fehérje a medúza fényszerveiben együttműködve alakítja át a kalcium által kiváltott lumineszcens jeleket a fajra jellemző zöld fluoreszcenciává.

Bár a zöld fluoreszcens fehérje génjét először 1992-ben klónozták, a molekuláris próbaként rejlő jelentős potenciált csak néhány évvel később realizálták, amikor fúziós termékeket alkalmaztak a génexpresszió nyomon követésére baktériumokban és nematódákban. A korai vizsgálatok óta a zöld fluoreszkáló fehérjét úgy tervezték, hogy rengeteg különböző színű mutánst, fúziós fehérjét és bioszenzort állítson elő, amelyeket széles körben fluoreszkáló fehérjéknek neveznek. Újabban más fajokból származó fluoreszcens fehérjéket azonosítottak és izoláltak, ami a színpaletta további bővülését eredményezte. A fluoreszcens fehérje technológia gyors fejlődésével e genetikailag kódolt fluorofor hasznossága széles körben alkalmazható az élő sejtekben a jelölt biomolekulák egyszerű követésén túl.

Ben illusztrált 1.ábra két példa arra, hogy élő sejtekben többszörös fluoreszcens fehérjejelölést alkalmaznak, amelyek a szubcelluláris (organellák) helyeket célzó fúziós termékeket használják. Az oposzum vesekéreg proximális tubulus hámsejtje (rendben sor) bemutatott 1(a) ábra transzfektáltuk a fluoreszcens fehérjevariánsok koktéljával, amelyek peptidjelekhez olvadtak, amelyek közvetítik a sejtmagba történő szállítást (fokozott cián fluoreszcens fehérje ECFP), a mitokondriumok (DsRed fluoreszcens fehérje DsRed2FP), vagy a mikrotubulus hálózat (fokozott zöld fluoreszkáló fehérje) EGFP). Hasonló minta, amely humán nyaki adenokarcinóma epiteliális sejtekből áll (HeLa sor) ábrázolja 1(b) ábra. A HeLa-sejteket cianánnal fuzionált sejt alatti lokalizációs vektorokkal együtt transzfektáltuk.mTürkiz) és sárga (mVénusz) fluoreszcens fehérjét kódoló szekvenciákat (Golgi komplex és a sejt), valamint a mitokondriális hálózatot célzó "gyümölcs" fehérjét, az mCherry -t.

A zöld fluoreszcens fehérjét és annak mutált allél formáit, a kék, a cián és a sárga fluoreszkáló fehérjéket fluoreszkáló kiméra fehérjék előállítására használják, amelyek élő sejtekben, szövetekben és egész szervezetekben expresszálhatók, a megtervezett vektorokkal történő transzfekció után. Vörös fluoreszkáló fehérjéket izoláltak más fajokból, beleértve a korallzátony szervezeteket is, és hasonlóan hasznosak. A fluoreszcens fehérje technikával elkerülhető a tisztítás, a jelölés és a jelölt fehérjék sejtekbe való bejuttatása, illetve a felszíni vagy belső antigének specifikus antitestek előállításának problémája.

Az Aequorea victoria Green Fluorescent Protein tulajdonságai és módosításai

A zöld fluoreszcens fehérje legfontosabb szempontjai közé tartozik, hogy a teljes 27 kiloDalton natív peptid szerkezet elengedhetetlen a fluoreszcencia kialakulásához és fenntartásához. Figyelemre méltó, hogy a fluorofór elve a szomszédos aminosavak hármasából származik: a szerin-, tirozin- és glicinmaradékokból a 65., 66. és 67. helyen (a továbbiakban: Ser65, Tyr66, és Gly67 lát 2. ábra). Bár ez az egyszerű aminosav motívum általában megtalálható a természetben, általában nem eredményez fluoreszcenciát. A fluoreszcens fehérje egyedi tulajdonsága, hogy ennek a peptid triplettnek a helye egy rendkívül stabil hordószerkezet közepén található, amely 11 béta-csőbe hajtogatott lapok.

A zöld fluoreszcens fehérje közepén lévő hidrofób környezetben reakció megy végbe a Ser65 karboxil-szénatomja és a Gly67 amino-nitrogénje között, ami egy imidazolin-5-on heterociklusos nitrogéngyűrűrendszer kialakulását eredményezi (ahogyan az ábrán látható). 2. ábra). A további oxidáció az imidazolingyűrű Tyr66 -val való konjugációját és egy fluoreszkáló faj érését eredményezi. Fontos megjegyezni, hogy a natív zöld fluoreszkáló fehérje fluorofor két állapotban létezik. Egy protonált forma, az uralkodó állapot, gerjesztési maximuma 395 nanométernél van, és egy kevésbé elterjedt, protonálatlan forma, amely körülbelül 475 nanométernél abszorbeál. A gerjesztési hullámhossztól függetlenül azonban a fluoreszcens emisszió maximális hullámhossza 507 nanométer, bár a csúcs széles és nem jól meghatározott.

2. ábra - Zöld fluoreszkáló fehérje fluorofór érlelés

A fluoreszcens fehérje fluorofor két domináns tulajdonsága fontos következményekkel jár a próbaként való használhatóság szempontjából. Először is, a zöld fluoreszcens fehérje, mint fluorofor, fotofizikai tulajdonságai meglehetősen bonyolultak, és így a molekula jelentős mennyiségű módosítást képes befogadni. Sok tanulmány a natív zöld fluoreszcens fehérje fluoreszcenciájának finomhangolására összpontosított, hogy széles körű molekuláris szondákat biztosítson, de nem lehet alábecsülni azt a jelentősebb és hatalmas potenciált, hogy a fehérjét kiindulási anyagként használják fel a fejlett fluoroforok létrehozásához. A zöld fluoreszkáló fehérje második fontos jellemzője, hogy a fluoreszcencia nagymértékben függ a tripeptid -fluorofort körülvevő molekuláris szerkezettől.

A zöld fluoreszcens fehérje denaturációja tönkreteszi a fluoreszcenciát, ahogy az várható is volt, és a tripeptid fluorofor körüli aminosavak mutációi drámai módon megváltoztathatják a fluoreszcens tulajdonságokat. Az aminosavmaradékok csomagolása a belsejében béta hordó rendkívül stabil, ami nagyon magas fluoreszcencia kvantumhozamot eredményez (akár 80 százalék). Ez a szűk fehérje szerkezet ellenállást is biztosít a fluoreszcencia változásokkal szemben, amelyek a pH, a hőmérséklet és a denaturálószerek, például a karbamid ingadozásai miatt következnek be. A magas szintű stabilitást általában negatív módon változtatják meg a zöld fluoreszcens fehérje mutációi, amelyek megzavarják a fluoreszcenciát, ami csökkenti a kvantumhozamot és nagyobb környezeti érzékenységet. Bár ezen hibák közül több is leküzdhető további mutációkkal, a származékos fluoreszcens fehérjék általában érzékenyebbek a környezetre, mint az őshonos fajok. Ezeket a korlátozásokat komolyan figyelembe kell venni a genetikai változatokkal végzett kísérletek tervezésekor.

Annak érdekében, hogy a fluoreszcens fehérjéket emlősrendszerekben való felhasználásra adaptálják, a vad típusú zöld fluoreszcens fehérje számos alapvető módosítását elvégezték, amelyek ma már az összes általánosan használt változatban megtalálhatók. Az első lépés a fluoreszcencia érésének optimalizálása volt 37 Celsius-fokos környezetre. A vad típusú fluorofor érése meglehetősen hatékony 28 fokon, de a hőmérséklet 37 fokra történő emelése lényegesen csökkenti az általános érést, és csökkenti a fluoreszcenciát. A fenil -alanin maradék mutációja a 64. pozícióban (Phe64). Ez a mutáció a fluoreszkáló fehérjék legnépszerűbb fajtáiban van jelen Aequorea victoria, de nem ez az egyetlen mutáció, amely javítja a 37 fokos hajtogatást, mivel más változatokat fedeztek fel.

Az érés 37 fokos javításán túl a kodonhasználat optimalizálása az emlősök expressziójára is javította az emlőssejtekben kifejezett zöld fluoreszcens fehérje általános fényerejét. Összesen több mint 190 néma mutációt vezettek be a kódoló szekvenciába, hogy fokozzák az expressziót az emberi szövetekben. Kozak transzlációs iniciációs hely (tartalmazza a nukleotidszekvenciát) A/GCCAT) is bevezetésre került a valin második aminosavként történő beiktatásával. Ezek, valamint számos egyéb fejlesztés (amelyeket alább tárgyalunk), egy nagyon hasznos szondát eredményeztek az emlőssejtek élő sejtes leképezésére, és közösek az összes jelenleg használt, az eredeti medúzafehérjéből származó fluoreszcens próbában.

A fluoreszkáló fehérje színpaletta

Fluoreszcens fehérje genetikai változatok széles skáláját fejlesztették ki, amelyek fluoreszcencia emissziós spektrumprofiljai szinte a teljes látható fényspektrumot átfogják (lásd. Asztal 1). Mutagenezis erőfeszítések az eredetiben Aequorea victoria A medúza zöld fluoreszcens fehérje új fluoreszcens szondákat eredményezett, amelyek színe kéktől sárgáig terjed, és ezek a legszélesebb körben használtak. in vivo riporter molekulák a biológiai kutatásban. A tengeri kökörcsinből kifejlesztettek hosszabb hullámhosszú fluoreszcens fehérjéket, amelyek a narancssárga és a vörös spektrális tartományban bocsátanak ki, Discosoma striata, és az osztályba tartozó zátonykorallok Anthozoa. Még más fajokat bányásztak ki, hogy hasonló fehérjéket állítsanak elő, amelyek ciánkék, zöld, sárga, narancssárga és mélyvörös fluoreszcenciát bocsátanak ki. Folyamatos fejlesztési kutatások folynak a fluoreszcens fehérjék fényességének és stabilitásának javítására, ezáltal javítva azok általános hasznosságát.

Asztal 1 - Fluoreszkáló fehérje tulajdonságok

Fehérje
(Betűszó)
Izgalom
Maximális
(nm)
Kibocsátás
Maximális
(nm)
Mól
Kihalás
Együttható
Kvantum
Hozam
in vivo
Szerkezet
Relatív
Fényerősség
(az EGFP% -a)
GFP (wt)395/47550921,0000.77Monomer*48
Zöld fluoreszcens fehérjék
EGFP48450756,0000.60Monomer*100
Smaragd48750957,5000.68Monomer*116
Szupermappás GFP48551083,3000.65Monomer*160
Azami Green49250555,0000.74Monomer121
mWasabi49350970,0000.80Monomer167
TagGFP48250558,2000.59Monomer*110
TurboGFP48250270,0000.53Dimer102
AcGFP48050550,0000.55Monomer*82
ZsGreen49350543,0000.91Tetramer117
T-zafír39951144,0000.60Monomer*79
Kék fluoreszkáló fehérjék
EBFP38344529,0000.31Monomer*27
EBFP238344832,0000.56Monomer*53
Azurit38445026,2000.55Monomer*43
mTagBFP39945652,0000.63Monomer98
Cián fluoreszkáló fehérjék
ECFP43947632,5000.40Monomer*39
mECFP43347532,5000.40Monomer39
Égszínkék43347543,0000.62Monomer*79
mTürkiz43447430,0000.84Monomer*75
CyPet43547735,0000.51Monomer*53
AmCyan145848944,0000.24Tetramer31
Midori-Ishi Cyan47249527,3000.90Dimer73
TagCFP45848037,0000.57Monomer63
mTFP1 (kékeszöld)46249264,0000.85Monomer162
Sárga fluoreszkáló fehérjék
EYFP51452783,4000.61Monomer*151
Topáz51452794,5000.60Monomer*169
Vénusz51552892,2000.57Monomer*156
mCitrine51652977,0000.76Monomer174
YPet517530104,0000.77Monomer*238
TagYFP50852464,0000.60Monomer118
PhiYFP525537124,0000.39Monomer*144
ZsSárga152953920,2000.42Tetramer25
mBanana5405536,0000.7Monomer13
Narancssárga fluoreszkáló fehérjék
Kusabira narancs54855951,6000.60Monomer92
Kusabira narancs255156563,8000.62Monomer118
mOrange54856271,0000.69Monomer146
mNarancs254956558,0000.60Monomer104
d Paradicsom55458169,0000.69Dimer142
dTomato-Tandem554581138,0000.69Monomer283
TagRFP555584100,0000.48Monomer142
TagRFP-T55558481,0000.41Monomer99
DsRed55858375,0000.79Tetramer176
DsRed256358243,8000.55Tetramer72
DsRed-Express (T1)55558438,0000.51Tetramer58
DsRed-Monomer55658635,0000.10Monomer10
mMandarin56858538,0000.30Monomer34
Piros fluoreszkáló fehérjék
mRuby558605112,0000.35Monomer117
mApple56859275,0000.49Monomer109
mEper57459690,0000.29Monomer78
AsRed257659256,2000.05Tetramer8
mRFP158460750,0000.25Monomer37
JRed58461044,0000.20Dimer26
mCherry58761072,0000.22Monomer47
HcRed158861820,0000.015Dimer1
mRaspberry59862586,0000.15Monomer38
dKeima-Tandem44062028,8000.24Monomer21
HcRed-Tandem590637160,0000.04Monomer19
mPlum59064941,0000.10Monomer12
AQ14359565590,0000.04Tetramer11
* Gyenge dimer

Bemutatva Asztal 1 a legnépszerűbb és leghasznosabb fluoreszcens fehérjeváltozatok által megjelenített tulajdonságok összeállítása. Az egyes fluoreszcens fehérjék általános nevével és/vagy rövidítésével együtt a csúcsabszorpciós és emissziós hullámhosszak (nanométerben megadva), a moláris kihalási együttható, a kvantumhozam, a relatív fényerő és in vivostrukturális egyesületek szerepelnek. A kiszámított fényerőértékeket a moláris extinkciós együttható és a kvantumhozam szorzatából származtattuk, osztva az EGFP értékével. Ez a felsorolás tudományos és kereskedelmi irodalmi forrásokból készült, és nem átfogó, hanem ehelyett fluoreszkáló fehérje -származékokat képvisel, amelyek jelentős figyelmet kaptak az irodalomban, és értékesnek bizonyulhatnak a kutatási erőfeszítések során. Ezenkívül a táblázatokban felsorolt ​​és az alábbiakban bemutatott abszorpciós és fluoreszcencia emissziós spektrumokat ellenőrzött körülmények között vettük fel, és csak összehasonlítás és megjelenítés céljából normalizáltuk. A tényleges fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatok során a spektrális profilok és a hullámhossz -maximumok változhatnak a környezeti hatások, például a pH, az ionkoncentráció és az oldószer polaritása, valamint a lokalizált szonda koncentrációjának ingadozása miatt. Ezért a felsorolt ​​kihalási együtthatók és kvantumhozamok eltérhetnek a kísérleti körülmények között ténylegesen megfigyelt értékektől.

Zöld fluoreszcens fehérjék

Bár a natív zöld fluoreszkáló fehérje jelentős fluoreszcenciát produkál és rendkívül stabil, a gerjesztési maximum közel van az ultraibolya tartományhoz. Mivel az ultraibolya fény különleges optikai megfontolásokat igényel, és károsíthatja az élő sejteket, általában nem alkalmas élő sejt optikai mikroszkópos képalkotásra. Szerencsére a zöld fluoreszkáló fehérje gerjesztési maximumát könnyen el lehet tolni 488 nanométerre (a cián régióban) azáltal, hogy egyetlen pont mutációt vezetünk be, amely megváltoztatja a 65 -ös pozícióban lévő szerint egy treonin -maradékká (S65T). Ez a mutáció szerepel a zöld fluoreszcens fehérje legnépszerűbb változatában, az úgynevezett továbbfejlesztett GFP (EGFP), amely kereskedelmi forgalomban kapható a BD Biosciences Clontech, a fluoreszcens fehérje technológia egyik vezetője által kínált vektorok széles skálájában. Ezenkívül a továbbfejlesztett változat leképezhető a fluoresceinhez tervezett, általánosan elérhető szűrőkészletek használatával, és a jelenleg rendelkezésre álló fluoreszkáló fehérjék közül a legfényesebb. Ezek a tulajdonságok a fokozott zöld fluoreszcens fehérjét az egyik legnépszerűbb szondává tették, és a legjobb választás a legtöbb egycímkés fluoreszcens fehérje kísérlethez. Az EGFP használatának egyetlen hátránya az enyhe pH -érzékenység és a gyenge dimerizálódási hajlam.

A fokozott zöld fluoreszkáló fehérje mellett számos más változatot is használnak az élősejtes képalkotásban. Ezek közül az egyik legjobb fotóstabilitás és fényerő tekintetében a Smaragd változat, de a kereskedelmi forrás hiánya korlátozta a használatát. Számos forrás kínál humanizált zöld fluoreszcens fehérje variánsokat, amelyek határozott előnyöket kínálnak a fluoreszcens rezonancia energiaátvitelben (FRET) kísérletek. A fenil -alanin maradék helyettesítése a 64. pozícióban a leucin (F64L GFP2) olyan mutánst eredményez, amely megtartja a 400 nanométeres gerjesztési csúcsot, és hatékony partnerként kapcsolható a fokozott sárga fluoreszkáló fehérjéhez. Egy változata a S65C a 474 nanométernél elért gerjesztési csúcsot jelentő mutációt (normálisan a ciszteint helyettesíti a szerinnel) a kereskedelemben bevezették, mint a fokozott kék fluoreszcens fehérje megfelelőbb FRET-partnerét, mint a vöröseltolódású fokozott zöld változat. Végül egy zátonykorall fehérje, az ún ZsGreen1 és amelynek emissziós csúcsa 505 nanométernél van, a fokozott zöld fluoreszcens fehérje helyettesítőjeként vezették be. Emlőssejtekben expresszálva a ZsGreen1 nagyon fényes az EGFP -hez képest, de korlátozottan használható a fúziós mutánsok előállításában, és más zátonykorall -fehérjékhez hasonlóan hajlamos tetramereket képezni.

Sárga fluoreszkáló fehérjék

A sárga fluoreszcens fehérjék családja azután indult be, hogy a zöld fluoreszcens fehérje kristályszerkezete feltárta, hogy a 203-as treoninmaradékThr203) a kromofor közelében volt. Ennek a maradéknak a tirozinná történő mutációját vezették be a kromofor gerjesztett állapotú dipólusmomentumának stabilizálására, és 20 nanométeres eltolódást eredményezett hosszabb hullámhosszokra mind a gerjesztési, mind az emissziós spektrumban. További finomítások vezettek a továbbfejlesztett sárga fluoreszkáló fehérje (EYFP), amely az egyik legfényesebb és legszélesebb körben használt fluoreszkáló fehérje. A fokozott sárga fluoreszcens fehérje fényessége és fluoreszcens emissziós spektruma együttesen teszi ezt a szondát kiváló jelöltté a fluoreszcens mikroszkópos többszínű képalkotó kísérletekhez. A továbbfejlesztett sárga fluoreszkáló fehérje szintén hasznos energiaátviteli kísérletekhez, ha továbbfejlesztett cián fluoreszkáló fehérjével párosítják (ECFP) vagy GFP2. A sárga fluoreszkáló fehérje azonban bizonyos problémákat okoz, mivel nagyon érzékeny a savas pH -ra, és a fluoreszcencia körülbelül 50 % -át elveszíti 6,5 pH -n. Ezenkívül az EYFP-ről kimutatták, hogy sokkal könnyebben érzékeny a kloridionokra és a fényes fehérítőkre, mint a zöld fluoreszcens fehérjék.

3. ábra - A közönséges fluoreszkáló fehérjék spektrális profiljai

A sárga emissziós fluoreszcens fehérje architektúra folyamatos fejlesztése számos problémát megoldott a sárga szondákkal. Az Citromsárga A sárga fluoreszkáló fehérje változata nagyon fényes az EYFP -hez képest, és bizonyítottan sokkal ellenállóbb a fényfehérítéssel, a savas pH -val és más környezeti hatásokkal szemben. Egy másik származék, név szerint Vénusz, a leggyorsabban érő és az egyik legfényesebb sárga változat, amelyet eddig fejlesztettek ki. A korallzátony fehérje, ZsYellow1, eredetileg klónozott a Zoanthus Az Indiai- és a Csendes-óceánban honos faj valódi sárga sugárzást produkál, és ideális többszínű alkalmazásokhoz. A ZsGreen1-hez hasonlóan ez a származék nem olyan hasznos fúziók létrehozására, mint az EYFP, és hajlamos tetramerek képzésére. A robusztusabb sárga fluoreszcens fehérje variánsok közül sok fontos volt a FRET vizsgálatok kvantitatív eredményeihez, és potenciálisan hasznosak lehetnek más vizsgálatokban is.

Ben illusztrált 3. ábra a sok általánosan használt és a kereskedelemben kapható fluoreszcens fehérje abszorpciós és emissziós spektrumprofiljai, amelyek a látható spektrumot lefedik a ciántól a vörösig. Az ebből származó változatok Aequorea victoria A medúzák, beleértve a továbbfejlesztett ciánkék, zöld és sárga fluoreszkáló fehérjéket, 425 és 525 nanométer közötti hullámhosszúak. A korallzátonyokból származó fluoreszcens fehérjék, a DsRed2 és a HcRed1 (lásd alább), hosszabb hullámhosszokat bocsátanak ki, de az emlőssejtekben az oligomerizációs műtermékektől szenvednek.

Kék és cián fluoreszkáló fehérjék

A zöld fluoreszcens fehérje kék és ciánkék változatai a tirozin maradék közvetlen módosításából származtak a 66. pozícióban (Tyr66) a natív fluoroforban (lásd 2. ábra). Ennek az aminosavnak a hisztidinné való átalakítása kék emissziót eredményez, amelynek hullámhossza maximuma 450 nanométer, míg a triptaminná történő átalakulás egy fő fluoreszcenciacsúcsot eredményez 480 nanométer körül, a váll pedig 500 nanométer körüli csúcsot eredményez.Mindkét szonda csak gyengén fluoreszkáló, és másodlagos mutációkat igényel a hajtogatási hatékonyság és az általános fényerő növelése érdekében. Még a módosításokkal is, a fluoreszkáló fehérjék ezen osztályának továbbfejlesztett változatai (EBFP és ECFP) csak körülbelül 25-40 százalékos fényességűek, mint a fokozott zöld fluoreszkáló fehérje. Ezenkívül a kék és cián fluoreszkáló fehérjék gerjesztése a leghatékonyabb azokban a spektrális régiókban, amelyeket nem gyakran használnak, ezért speciális szűrőkészletekre és lézerforrásokra van szükség.

A kék és cián fluoreszcens fehérjék hátrányai ellenére a többszínű jelölés és a FRET iránti széles körű érdeklődés számos vizsgálatban népszerűsítette alkalmazásukat. Ez különösen igaz a továbbfejlesztett cián fluoreszcens fehérjére, amelyet a csúcson kívül gerjeszthet egy argon-ion lézer (a 457 nanométeres spektrális vonal segítségével), és lényegesen ellenállóbb a fényfehérítéssel szemben, mint a kék származék. Más fluoreszcens fehérjékkel ellentétben nem volt nagy érdeklődés a jobb szondák tervezése iránt a látható fény spektrumának kék tartományában, és az ebbe az osztályba tartozó fluoroforokkal kapcsolatos fejlesztési kutatások többsége ciánkék változatokra összpontosított.

4. ábra - Fluoreszcens fehérje FRET vödörváltozatok spektrális profilja

A bevezetett továbbfejlesztett cián fluoreszkáló fehérjék közül AmCyan1 és egy továbbfejlesztett ciánkék változat Égszínkék mutassa a legtöbb ígéretet. A zátonykorallból származik, Anemonia majanoAz AmCyan1 fluoreszcens fehérje variánst humán kodonokkal optimalizálták, hogy magas relatív fényerősséget és ellenállást biztosítsanak a fehérítő fehérjével szemben, összehasonlítva az emlősök expressziója során kifejlesztett cián fluoreszkáló fehérjével. Hátránya, hogy a legtöbb zátonykorallfehérjéhez hasonlóan ez a szonda hajlamos tetramerek képzésére. A Cerulean fluoreszcens szondát fokozott cián fluoreszcens fehérje helyspecifikus mutagenezisével fejlesztették ki, hogy magasabb extinkciós együtthatót és jobb kvantumhozamot kapjanak. A Cerulean legalább kétszer fényesebb, mint a továbbfejlesztett cián fluoreszkáló fehérje, és bizonyítottan jelentősen növeli a jel-zaj arányt, ha sárga fényt kibocsátó fluoreszkáló fehérjékkel, például Vénusszal kombinálják (ld. 4. ábra), a FRET vizsgálatok során.

Piros fluoreszkáló fehérjék

A fluoreszcens fehérje fejlesztésének egyik fő célja egy olyan vörös sugárzást kibocsátó származék létrehozása, amely egyenlő vagy meghaladja a fokozott zöld fluoreszcens fehérje fejlett tulajdonságait. A megfelelő vörös fluoreszkáló fehérje előnyei közé tartozik a potenciális kompatibilitás a meglévő konfokális és széles látószögű mikroszkópokkal (és azok szűrőkészleteivel), valamint a megnövekedett képesség az egész állatok leképezésére, amelyek lényegesen átláthatóbbak a vörös fényben. Mivel a vöröseltolódott mutánsok felépítése a Aequorea victoria A medúza zöld fluoreszkáló fehérje a sárga spektrális régión túl nagyrészt sikertelennek bizonyult, a kutatók a trópusi zátonykorallokra irányították a keresést.

Az első korallból származó fluoreszcens fehérje, amelyet széles körben alkalmaztak, származott Discosoma striata és általában úgy emlegetik DsRed. A teljes érettség után a DsRed fluoreszcencia emissziós spektrumának csúcsa 583 nanométernél van, míg a gerjesztési spektrum fő csúcsa 558 nanométernél és egy kisebb csúcs 500 nanométer körül van. A DsRed használatával azonban számos probléma társul. A DsRed fluoreszcencia érése lassan következik be, és egy olyan időszakon keresztül tart, amikor a fluoreszcencia emisszió a zöld tartományban van. Nevezték a zöld állapot, ez a műtermék problémásnak bizonyult más zöld fluoreszcens fehérjékkel végzett többszöri jelölési kísérleteknél a spektrális átfedés miatt. Ezenkívül a DsRed kötelező tetramer, és nagy fehérjeaggregátumokat képezhet az élő sejtekben. Bár ezek a jellemzők jelentéktelenek a DsRed génexpressziós riporterként való használatához, a DsRed epitóp -címke haszna erősen korlátozott. Ellentétben a medúza fluoreszcens fehérjékkel, amelyeket sikeresen használtak több száz fehérje jelölésére, a DsRed konjugátumok sokkal kevésbé sikeresek és gyakran mérgezőek.

A DsRed fluoreszcens fehérjékkel kapcsolatos néhány problémát mutagenezissel sikerült megoldani. A második generációs DsRed, az úgynevezett DsRed2, számos mutációt tartalmaz a peptid aminoterminálisán, amelyek megakadályozzák a fehérje aggregátumok képződését és csökkentik a toxicitást. Ezenkívül ezekkel a módosításokkal csökken a fluorofór érési ideje. A DsRed2 fehérje még mindig tetramert képez, de a gyorsabb érés miatt több címkézési kísérletben jobban kompatibilis a zöld fluoreszkáló fehérjékkel. Az érési idő további csökkentése valósult meg a DsRed mutánsok harmadik generációjával, amelyek szintén megnövelt fényerősséget mutatnak a csúcssejt fluoreszcencia szempontjából. Piros fluoreszcencia emisszió DsRed-Express expresszió után egy órán belül megfigyelhető, míg a DsRed2 esetében körülbelül hat, míg a DsRed esetében 11 órával. Egy élesztőre optimalizált változat, az ún Vörös csillag, fejlesztették ki, amely javított érlelési sebességgel és nagyobb fényerővel rendelkezik. A zöld állapot jelenléte a DsRed-Express-ben és a RedStar-ban nem nyilvánvaló, így ezek a fluoreszkáló fehérjék a legjobb választás a narancssárga-vörös spektrális régióban több jelölési kísérlethez. Mivel ezek a szondák kötelező tetramerek maradnak, nem a legjobb választás a fehérjék jelölésére.

5. ábra - Narancssárga és vörös monometriás fluoreszcens fehérjék spektrális profilja

Számos további vörös fluoreszcens fehérjét izoláltak a zátonykorall szervezetekből, amelyek jelentős mértékben ígéretesek. Az egyik első, amelyet emlősök számára alkalmaznak, az HcRed1, amitől elszigetelték Heteractis crispa és ma már kereskedelmi forgalomban is kapható. A HcRed1 eredetileg egy nem fluoreszcens kromoproteinből származik, amely mutagenezis révén elnyeli a vörös fényt, és egy gyengén fluoreszkáló obligát dimert hoz létre, amelynek abszorpciós maximuma 588 nanométer és emissziós maximuma 618 nanométer. Annak ellenére, hogy ennek a fehérjének a fluoreszcencia-emissziós spektruma megfelelő a DsRed-től való elválasztáshoz, hajlamos a DsRed-rel együtt aggregálódni, és sokkal kevésbé világos. Egy érdekes HcRed konstrukciót állítottak elő, amely két molekulát párhuzamosan tartalmaz a dimerizáció leküzdésére, amely elvileg elsősorban a tandem párosításban megy végbe, és monomer jelölést hoz létre. Mivel azonban ennek az ikerfehérjének a fényereje még nem javult, ez nem jó választás az élősejtes mikroszkópia rutinszerű alkalmazásaihoz.

Monomer fluoreszcens fehérje variánsok fejlesztése

Természetes állapotában a legtöbb fluoreszcens fehérje dimerként, tetramerként vagy magasabb rendű oligomerként létezik. Hasonlóképpen, Aequorea victoria a zöld fluoreszcens fehérjékről feltételezik, hogy részt vesznek a tetramer komplexben aequorinnal, de ezt a jelenséget csak nagyon magas fehérjekoncentrációnál figyelték meg, és a medúza fluoreszcens fehérjék dimerizálódási tendenciája általában nagyon gyenge (disszociációs állandójuk nagyobb, mint 100 mikromól). A fluoreszcens fehérjék dimerizációját így általában nem figyelték meg, amikor emlősrendszerekben expresszálódnak. Ha azonban a fluoreszcens fehérjéket specifikus sejtkompartmentekre, például a plazmamembránra irányítják, a lokalizált fehérjekoncentráció elméletileg elég magas lehet ahhoz, hogy lehetővé tegye a dimerizációt. Ez különösen aggodalomra ad okot a FRET kísérletek során, amelyek összetett adathalmazokat eredményezhetnek, amelyeket a dimerizációs műtermékek könnyen veszélyeztetnek.

A monomer DsRed variánsok megalkotása nehéz feladatnak bizonyult. Az első generációs monomer DsRed fehérje (ún. RFP1). Ez a származék azonban jelentősen csökkent fluoreszcens emissziót mutat a natív fehérjéhez képest, és nagyon gyorsan kifehéredik, így sokkal kevésbé hasznos, mint a monomer zöld és sárga fluoreszcens fehérjék. A mutagenezis kutatási erőfeszítései, beleértve az új technikákat, mint például a szomatikus hipermutáció, továbbra is a sárga, narancssárga, piros és mélyvörös fluoreszcens fehérjeváltozatok keresésében folytatódnak, amelyek tovább csökkentik ezen potenciálisan hatékony biológiai szondák önálló társulási hajlamát, miközben egyidejűleg növelik a kibocsátási maximumokat hosszabb hullámhosszok felé.

Továbbfejlesztett monomer fluoreszcens fehérjéket fejlesztenek ki, amelyek megnövelt extinkciós együtthatókkal, kvantumhozammal és fotostabilitással rendelkeznek, bár egyetlen variánst még nem optimalizáltak minden kritérium szerint. Ezenkívül a kötelező tetramer vörös fluoreszcens fehérjék expressziós problémáit leküzdik a monomer variánsok előállítására irányuló erőfeszítések, amelyek olyan származékokat eredményeztek, amelyek jobban kompatibilisek a biológiai funkcióval.

Talán a leglátványosabb fejlemény ezen a téren a monomer vörös fluoreszcens fehérjéből származó fluoreszcens fehérjék új gyűjteményének bevezetése volt irányított mutagenezis révén, amely a Q66 és Y67 maradványok. A gyümölcsökről nevezték el, amelyek a fluoreszcencia emissziós spektrális profiljához hasonló színeket tükröznek (lásd Asztal 1 és 5. ábra), ez a monomer fluoreszcens fehérjék köre 560 és 610 nanométer közötti hullámhosszon mutatja a maximumokat. Ennek az osztálynak az iteratív szomatikus hipermutáción keresztül történő további kiterjesztése fluoreszcens fehérjéket eredményezett, amelyek emissziós hullámhossza akár 650 nanométer. Ezek az új fehérjék lényegében kitöltik a szakadékot a leginkább vöröseltolódott medúza fluoreszcens fehérjék (például a Vénusz) és a korallzátony vörös fluoreszkáló fehérjék között. Bár ezek közül az új fluoreszcens fehérjék közül soknak hiányzik a fényereje és a stabilitása, amely sok képalkotó kísérlethez szükséges, létezésük biztató, mivel azt sugallja, hogy a fényes, stabil, monomer fluoreszcens fehérjék eshetősége a teljes látható spektrumon belül van.

Optikai kiemelők

A fluoreszcens fehérje kutatás egyik legérdekesebb fejleménye ezen szondák alkalmazása volt molekuláris vagy optikai kiemelők (lát 2. táblázat), amelyek megváltoztatják a színt vagy a kibocsátási intenzitást a külső foton stimuláció vagy az idő múlásával. Például a natív medúzapeptid egyetlen pontmutációja létrehozza a zöld fluoreszkáló fehérje (az úgynevezett PA-GFP), amely lehetővé teszi a gerjesztési csúcs fotokonvertálását ultraibolya fényről kékre a 400 nanométeres fénnyel történő megvilágítással. A nem konvertált PA-GFP gerjesztési csúcsa hasonló profilú, mint a vad típusú fehérjeé (körülbelül 395-400 nanométer). A fotokonverzió után a gerjesztési csúcs 488 nanométernél körülbelül 100-szorosára nő. Ez az esemény nagyon nagy kontrasztkülönbségeket idéz elő a PA-GFP nem konvertált és átalakított készletei között, és hasznos a sejten belüli molekuláris alpopulációk dinamikájának nyomon követésében. Ben illusztrált 6. a) ábra egy transzfektált élő emlős sejt, amely PA-GFP-t tartalmaz a citoplazmában, amelyet 488 nanométeres argon-ion lézeres gerjesztéssel készítettek.6(a) ábra) és utána (6(d) ábra) fotokonverzió 405 nanométeres kék diódás lézerrel.

2. táblázat - A kiválasztott optikai kiemelők tulajdonságai

Fehérje
(Betűszó)
Izgalom
Maximális
(nm)
Kibocsátás
Maximális
(nm)
Mól
Kihalás
Együttható
Kvantum
Hozam
in vivo
Szerkezet
Relatív
Fényerősség
(az EGFP% -a)
PA-GFP (G)50451717,4000.79Monomer41
PS-CFP (C)40246834,0000.16Monomer16
PS-CFP (G)49051127,0000.19Monomer15
PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08Monomer3
CoralHue Kaede (G)50851898,8000.88Tetramer259
CoralHue Kaede (R)57258060,4000.33Tetramer59
wtKikGR (G)50751753,7000.70Tetramer112
wtKikGR (R)58359335,1000.65Tetramer68
mKikGR (G)50551549,0000.69Monomer101
mKikGR (R)58059128,0000.63Monomer53
dEosFP-Tandem (G)50651684,0000.66Monomer165
dEosFP-Tandem (R)56958133,0000.60Monomer59
mEos2FP (G)50651956,0000.84Monomer140
mEos2FP (R)57358446,0000.66Monomer90
Dendra2 (G)49050745,0000.50Monomer67
Dendra2 (R)55357335,0000.55Monomer57
CoralHue Dronpa (G)50351895,0000.85Monomer240
Gyújtás (KFP1)58060059,0000.07Tetramer12

Más fluoreszkáló fehérjék is alkalmazhatók optikai kiemelőként. A DsRed fluoreszcens fehérje háromfoton gerjesztése (kevesebb, mint 760 nanométeren) képes a normálisan vörös fluoreszcenciát zöldre váltani. Ez a hatás valószínűleg a DsRed vörös kromofórjainak szelektív fényfehérítéséből adódik, ami a zöld állapotból megfigyelhető fluoreszcenciát eredményez. Az Időzítő A DsRed változata néhány óra alatt fokozatosan élénkzöldről (500 nanométeres kibocsátás) világospirosra (580 nanométeres kibocsátás) változik. A zöld-piros fluoreszcencia relatív aránya ezután felhasználható időbeli adatok gyűjtésére a génexpressziós vizsgálatokhoz.

Fényképesen kapcsolható optikai kiemelő, ún PS-CFPEgy zöld fluoreszcens fehérje variáns mutageneziséből származó 405 nanométeres megvilágítás hatására ciánból zöld fluoreszcenciára vált át (figyeljük meg a központi sejt fotokonverzióját 6. b) és 6. e) ábra). Monomerként kifejezve ez a szonda potenciálisan hasznos lehet a fényfehérítés, a fotokonverzió és a fotoaktiválás vizsgálatokban. A PS-CFP-ből származó fluoreszcencia azonban megközelítőleg 2,5-szer halványabb, mint a PA-GFP, és a fotokonverziós hatékonyság tekintetében alacsonyabb a többi kiemelőnél (a fotonverzió során a fluoreszcencia emissziójának 40 nanométeres eltolódása kisebb, mint a hasonló szondákkal tapasztalt). Ezen vagy rokon fluoreszcens fehérjék további mutagenezisével több hasznos variáns keletkezhet ebben a hullámhossz-tartományban.

6. ábra - Optikai kiemelő fluoreszkáló fehérjék

Optikai kiemelőket korall- és kökörcsinfajokból klónozott fluoreszcens fehérjékben is kifejlesztettek. Kaede, a köves korallokból izolált fluoreszkáló fehérje, a fényt ultraibolya fény jelenlétében zöldről vörösre alakítja. A PA-GFP-vel ellentétben a Kaede-ben a fluoreszcencia átalakulása a fény abszorpciójával történik, amely spektrálisan különbözik a megvilágítástól. Sajnos ez a fehérje kötelező tetramer, ezért kevésbé alkalmas szőrme használatára epitóp címkeként, mint a PA-GFP. Egy másik tetramer köves korall (Lobophyllia hemprichii) fluoreszcens fehérje variáns, ún EosFP (lát 2. táblázat), élénkzöld fluoreszcenciát bocsát ki, amely narancsvörösre változik, ha körülbelül 390 nanométeres ultraibolya fénnyel megvilágítják. Ebben az esetben a spektrális eltolódást egy fotó által kiváltott módosítás eredményezi, amely a kromofórral szomszédos peptid gerincének megszakadásával jár. A "vad típusú" EosFP fehérje további mutagenezise monomer származékokat eredményezett, amelyek hasznosak lehetnek fúziós fehérjék előállításában.

Egy harmadik nemAequorea optikai kiemelő, a Aprófa fluoreszcens fehérje (KFP1) izolált nem fluoreszkáló kromoproteinből fejlesztették ki Anemonia sulcata, és már a kereskedelemben is elérhető (Evrogen). A gyújtó fluoreszkáló fehérje nem mutat emissziót, amíg meg nem világítja zöld fénnyel. Az alacsony intenzitású fény átmeneti vörös fluoreszcenciát eredményez, amely néhány perc alatt lecseng (lásd a mitokondriumokat 6. ábra (c)). A kék fénnyel való megvilágítás azonnal leállítja a felgyújtott fluoreszcenciát, lehetővé téve a fluoreszkáló címkézés szigorú ellenőrzését. Ezzel szemben a nagy intenzitású megvilágítás visszafordíthatatlan gyújtást eredményez, és lehetővé teszi a PA-GFP-hez hasonló stabil kiemelést (6(f) ábra). A fluoreszcencia pontos szabályozásának képessége különösen hasznos a részecskék mozgásának nyomon követésében zsúfolt környezetben. Ezt a megközelítést például sikeresen alkalmazták a neurális lemezsejtek sorsának nyomon követésére a fejlődés során Xenopus embriók és az egyes mitokondriumok mozgása a PC12 sejtekben.

Ahogy az optikai kiemelők fejlesztése folytatódik, az optikai jelöléshez hasznos fluoreszkáló fehérjéknek világosabb, monomer változatok felé kell fejlődniük, amelyek könnyen fotokonvertálhatók és az emissziós színek széles spektrumát mutatják. Ezekkel a fejlesztésekkel párosulva a sejtbiológiai laboratóriumokban mindennapossá válnak a fluoreszcencia-megfigyelés és a regionális jelölés megvilágítási módok közötti zökkenőmentes összehangolására felszerelt mikroszkópok. Végső soron ezek az újítások jelentős eredményeket érhetnek el a jelátviteli rendszerek térbeli és időbeli dinamikájában.

Fluoreszcens fehérjevektorok és géntranszfer

A fluoreszkáló fehérjék meglehetősen sokoldalúak, és sikeresen alkalmazták szinte minden biológiai tudományágban, a mikrobiológiától a rendszerélettanig. Ezek a mindenütt jelenlévő próbák rendkívül hasznosak voltak riporterként tenyésztett sejtekben és szövetekben, valamint élő állatokban végzett génexpressziós vizsgálatokhoz. Élő sejtekben a fluoreszcens fehérjéket leggyakrabban a fehérjék, organellumok és más sejtkompartmentek lokalizációjának és dinamikájának nyomon követésére használják. Különféle technikákat fejlesztettek ki a fluoreszcens fehérjefúziós termékek előállítására és azok expressziójának fokozására emlősökben és más rendszerekben. A fluoreszcens fehérje kiméra génszekvenciák sejtekbe történő bevitelének elsődleges hordozói a genetikailag módosított bakteriális plazmidok és vírusvektorok.

A fluoreszcens fehérje génfúziós termékeit a megfelelő vektor (általában plazmid vagy vírus) segítségével átmenetileg vagy stabilan bejuttathatjuk emlős- és más sejtekbe. Átmeneti vagy ideiglenes géntranszfer kísérletekben (gyakran ún átmeneti transzfekció), a gazdaszervezetbe bejuttatott plazmid vagy vírus DNS nem feltétlenül integrálódik a kromoszómákba, de rövid ideig expresszálható a citoplazmában. A génfúziós termékek expressziója, amelyet a fluoreszcencia -emisszió megfigyelésével könnyen nyomon lehet követni a fluoreszcens fehérjével kompatibilis szűrőkészlettel, általában a transzfekciót követő néhány órában megy végbe, és a plazmid -DNS emlőssejtekbe történő bevitele után 72-96 órán keresztül folytatódik. . Sok esetben a plazmid DNS állandó állapotban beépülhet a genomba, hogy stabilan transzformált sejtvonalakat hozzunk létre. Az átmeneti vagy stabil transzfekció kiválasztása a vizsgálat célkitűzéseitől függ.

7. ábra - EYFP endoplazmatikus retikulum lokalizációs vektor

A fluoreszcens fehérje génátviteli kísérletekben használható alapvető plazmidvektor -konfiguráció számos szükséges összetevőt tartalmaz. A plazmidnak tartalmaznia kell a DNS bakteriális replikációs eredetét kódoló prokarióta nukleotidszekvenciákat és egy antibiotikum rezisztencia gént. Ezeket az elemeket gyakran nevezik űrsikló szekvenciák, lehetővé teszik a plazmid szaporítását és szelektálását bakteriális gazdaszervezetben, hogy elegendő mennyiségű vektor keletkezzen az emlős transzfekciókhoz. Ezenkívül a plazmidnak tartalmaznia kell egy vagy több eukarióta genetikai elemet, amelyek szabályozzák a hírvivő RNS transzkripció iniciálását, egy emlős poliadenilációs szignált, egy intront (opcionális) és egy gént az emlőssejtekben történő szelekcióhoz. A transzkripciós elemek szükségesek ahhoz, hogy az emlős gazdaszervezet kifejezze az érdeklődésre számot tartó génfúziós terméket, és a szelekciós gén általában egy antibiotikum, amely ellenállást biztosít a plazmidot tartalmazó sejtekkel szemben.Ezek az általános jellemzők a plazmid kialakításától függően változnak, és sok vektor széles körű kiegészítő komponensekkel rendelkezik, amelyek alkalmasak bizonyos alkalmazásokra.

Ben illusztrált 7. ábra a kereskedelemben kapható (BD Biosciences Clontech) bakteriális plazmidszármazék restrikciós enzimje és genetikai térképe, amely a calreticulin (rezidens fehérje) endoplazmatikus retikulum célzó szekvenciájához fuzionált, fokozott sárga fluoreszcens fehérje kódoló szekvenciáját tartalmazza. Ennek a génterméknek az érzékeny emlőssejtekben történő expressziója kiméra peptidet eredményez, amely EYFP -t tartalmaz, amely az endoplazmatikus retikulum membránhálózatban lokalizálódik, és amelyet kifejezetten ennek az organellának fluoreszkáló jelölésére terveztek. A gazdavektor a származéka pUC nagy kópiaszámú (kb. 500) plazmid, amely a bakteriális replikációs origót tartalmazza, amely alkalmassá teszi speciális szaporodásra E. coli törzsek. A kanamicin antibiotikum gén könnyen expresszálódik a baktériumokban, és rezisztenciát biztosít, hogy szelektálható markerként szolgáljon.

A fent bemutatott EYFP vektor további jellemzői egy humán citomegalovírus (CMV) promoter gén expresszió elősegítésére transzfektált humán és más emlős sejtvonalakban, és egy f1 bakteriofág replikációs origó az egyszálú DNS előállításához. A vektor gerince egy 40-es majomvírust is tartalmaz (SV40) replikációs origó, amely aktív az SV40 T-antigént expresszáló emlőssejtekben. Stabil transzfektánsok kiválasztása az antibiotikummal G418 engedélyezett egy neomicin-rezisztencia kazettával, amely az SV40 korai promoterből, a neomicin-rezisztencia génből (aminoglikozid 3'-foszfotranszferáz) és a herpes simplex vírus timidin-kináz poliadenilációs jeleiből áll (HSV-TK) a hírnök stabilitása érdekében. Hat egyedi restrikciós enzimhely (lásd 7. ábra) vannak jelen a plazmid gerincén, ami növeli ennek a plazmidnak a sokoldalúságát.

Fluoreszcens fehérjeplazmidok szaporítása, izolálása és transzfekciója

A sikeres emlős transzfekciós kísérletek kiváló minőségű plazmid vagy virális DNS vektorok használatán alapulnak, amelyek viszonylag mentesek a bakteriális endotoxinoktól. Natív állapotban a kör alakú plazmid DNS molekulák harmadlagosak túlcsévélve konformáció, amely a kettős hélixet többször is maga köré csavarja. Sok éven át a szuperspirált plazmid és vírus DNS tisztításának választott módszere a cézium-klorid sűrűséggradiens centrifugálás volt interkalációs ágens (például etídium-bromid vagy propidium-jodid) jelenlétében. Ez a technika, amely mind a berendezések, mind az anyagok tekintetében drága, a szupertekercselt (plazmid) DNS -t elkülöníti a lineáris kromoszóma és a becsapott kör alakú DNS -től a lebegő sűrűség szerint, lehetővé téve a nagy tisztaságú plazmid DNS gyűjtését. A közelmúltban egyszerűsített ioncserélő oszlopkromatográfiás módszereket (általában a mini előkészítés) nagymértékben kiszorították a nehézkes és időigényes centrifugálási protokollt, hogy viszonylag rövid idő alatt nagy mennyiségű endotoxin-mentes plazmid DNS-t kapjanak.

Speciális bakteriális mutánsok, ún illetékes sejteket plazmidvektorok kényelmes és viszonylag olcsó amplifikálására fejlesztették ki. A baktériumok olyan mutációk palettáját tartalmazzák, amelyek különösen érzékenyek a plazmid replikációjára, és kémiailag permeabilizálták őket, hogy a DNS-t a membránon és a sejtfalon keresztül vigyék át az úgynevezett eljárással. átalakítás. A transzformáció után a baktériumokat logaritmikus fázisba növesztjük a plazmid által diktált szelekciós antibiotikum jelenlétében. A baktériumtenyészetet centrifugálással betöményítik, és a szennyező RNS lebontására enzimeket tartalmazó lúgos detergens oldattal végzett lízissel felbontják. A lizátumot ezután szűrjük, és az ioncserélő oszlopra helyezzük. A nem kívánt anyagokat, beleértve az RNS-t, DNS-t és fehérjéket, alaposan kimossuk az oszlopról, mielőtt a plazmid DNS-t nagy sótartalmú pufferrel eluáljuk. Az alkoholos (izopropanol) precipitáció az eluált plazmid DNS-t koncentrálja, amelyet centrifugálással összegyűjtünk, mosunk, majd pufferben újra feloldunk. A tisztított plazmid DNS készen áll a transzfekciós kísérletekre.

8. ábra - Lipidközvetített transzfekció emlőssejtekben

A transzfekcióhoz használt emlőssejteknek kiváló fiziológiai állapotban kell lenniük, és logaritmikus fázisban kell növekedniük az eljárás során. A kereskedelemben a transzfekciós reagensek széles spektrumát fejlesztették ki, hogy optimalizálják a plazmid DNS tenyésztett sejtek általi felvételét. Ezek a technikák az egyszerű kalcium -foszfát -kicsapástól a plazmid -DNS lefoglalásáig terjednek a lipidvezikulákban, amelyek összeolvadnak a sejtmembránnal, és a tartalmat a citoplazmába juttatják (amint azt a 8. ábra). Összefoglaló néven lipofekció, a lipid alapú technológia széles körben elfogadott, mivel számos népszerű sejtvonalban hatékony, és mára ez a módszer a legtöbb transzfekciós kísérletben.

Bár az átmeneti transzfekciók általában a plazmid géntermék elvesztését eredményezik viszonylag rövid időn (több napon) keresztül, a stabilan transzfektált sejtvonalak továbbra is folyamatosan, hosszú ideig (hónapoktól évekig) termelik a vendégfehérjéket. A stabil sejtvonalakat a plazmid gerincében lévő antibiotikus markerek segítségével választhatjuk ki (lásd 7. ábra). Az egyik legnépszerűbb antibiotikum a stabil transzfektánsok kiválasztására emlőssejtvonalakban a fehérjeszintézist gátló G418 gyógyszer, de a szükséges dózis nagymértékben változik az egyes sejtvonalaktól függően. Egyéb gyakori antibiotikumok, beleértve hidromicin-B és puromicin, szintén stabil sejtszelekcióra fejlesztették ki, csakúgy, mint a genetikai markereket. A stabil sejtvonalak előállításának leghatékonyabb módja a nagy hatékonyságú technika alkalmazása a kezdeti transzfekcióhoz. Ebben a tekintetben, elektroporáció bizonyítottan stabil transzfektánsokat termel linearizált plazmidokkal és tisztított génekkel. Az elektroporáció rövid, nagyfeszültségű impulzusokat alkalmaz a sejtszuszpenzióra, hogy pórusképződést indukáljon a plazmamembránban, majd lehetővé téve a transzfekciós DNS bejutását a sejtbe. Az elektroporációhoz speciális berendezésekre van szükség, azonban a technika költsége összehasonlítható a lipofekciós reagensekkel, ha nagyszámú transzfekciót hajtanak végre.

A fluoreszkáló fehérjék jövője

A jelenlegi fluoreszcens fehérjefejlesztés középpontjában két alapvető cél áll. Az első, hogy tökéletesítsük és finomhangoljuk a kék-sárga fluoreszkáló fehérjék jelenlegi palettáját Aequorea victoria medúzák, míg a második cél a látható fényspektrum narancssárga és távoli vörös tartományaiban kibocsátó monomer fluoreszcens fehérjék kifejlesztése. A célok felé tett előrehaladás meglehetősen lenyűgöző volt, és nem elképzelhetetlen, hogy infravörös közeli fluoreszkáló fehérjék jelennek meg a horizonton.

A medúzaváltozatok legújabb generációja megoldotta az első generációs fluoreszkáló fehérjék hiányosságait, különösen a sárga és a zöld származékok esetében. A monomer, fényes és gyorsan érő vörös fluoreszkáló fehérje keresése számos új és érdekes fluoreszcens fehérjeosztályt eredményezett, különösen azokat, amelyek korallfajokból származnak. A meglévő fluoreszcens fehérjék fejlesztése új technológiákkal együtt, mint például a nem természetes aminosavak beiktatása, tovább bővíti a színpalettát. Ahogy az optikai spektrális szétválasztási technikák egyre fejlettebbek és egyre szélesebb körben elterjednek, ezek az új változatok kiegészítik a meglévő palettát, különösen a spektrum sárga és vörös tartományában.

A fluoreszcens szonda technológia jelenlegi tendenciája, hogy a távoli vörösre és a közeli infravörösre fluoreszkáló festékek szerepét bővítik. Emlőssejtekben mind az autofluoreszcencia, mind a fényelnyelés jelentősen csökken a spektrum vörös végén. Így a távoli vörös fluoreszcens szondák kifejlesztése rendkívül hasznos lenne vastag példányok és egész állatok vizsgálatára. Tekintettel a fluoreszcens fehérjék sikerességére a transzgenikus rendszerek riportereiként, az elkövetkező években egyre fontosabbá válik a távoli vörös fluoreszcens fehérjék egész szervezetekben való alkalmazása.

Végezetül, a fluoreszcens fehérje alkalmazásokban rejlő óriási lehetőségek a bioszenzorok tervezésében csak most valósulnak meg. A bioszenzor konstrukciók száma gyorsan növekszik. A szerkezeti információk felhasználásával e szondák fejlesztése javította az érzékenységet, és ez a jövőben is így lesz. E törekvések sikere mindenképpen azt sugallja, hogy szinte bármilyen biológiai paraméter mérhető lesz a megfelelő fluoreszcens fehérje alapú bioszenzorral.

Közreműködő szerzők

David W. Piston - Molekuláris Fiziológiai és Biofizikai Tanszék, Vanderbilt Egyetem, Nashville, Tennessee, 37232.

George H. Patterson és Jennifer Lippincott-Schwartz - Sejtbiológiai és anyagcsere -ág, Nemzeti Gyermekegészségügyi és Emberi Fejlődési Intézet, Nemzeti Egészségügyi Intézetek, Bethesda, Maryland, 20892.

Nathan S. Claxton és Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Kapcsolódó Nikon termékek

Fluoreszkáló szűrőkockák

A Nikon a fluoreszcens szűrőkockák széles választékát kínálja nagy fluoreszcencia-felvételi hatékonysággal, hogy támogassa a fluoroforok és fluoreszcens fehérjék széles választékának képalkotását.

Fényforrások

A Nikon a képalkotási igények széles körére kínál fényforrásokat, a sztereomikroszkópos koaxiális rendszerektől az epifluoreszcens alkalmazásokhoz használt LED-alapú megvilágítókig, valamint a fejlett képalkotási alkalmazásokhoz szükséges nagy teljesítményű lézeregységekig. Számos világítási megoldásunk egyedi megvalósítást tartalmaz, és kiváltható a nagy sebességű vezérléshez.


Mi az az YFP

Az YFP (sárga fluoreszcens fehérje) egy genetikai mutációként bevezetett GFP származék. Valójában ez egy színmutáns, amelyet a T203Y mutáció valósított meg. Ez π-elektron halmozási kölcsönhatásokat eredményez a szubsztituált tirozinmaradék és a kromofor között. Ezért az YFP 514 nm hullámhosszon nyeli el a zöld színű fényt, miközben 527 nm-en bocsát ki sárga színű fényt.

4. ábra: GFP -származékok

Ezenkívül a Citrine, a Venus és az YPet az YFP három továbbfejlesztett változata. Közös tulajdonságokkal rendelkeznek, beleértve a klorid érzékenység csökkenését, a gyorsabb érést és a nagyobb fényerőt. Az YFP legfontosabb jelentősége a molekuláris biológiában az, hogy a genetikailag kódolt FRET (Förster rezonancia energiaátadás) érzékelők elfogadójaként szolgáljon. Itt a leggyakoribb donor fluoreszcens fehérje a monomer cián fluoreszcens fehérje (mCFP), amely egy másik GFP származék.


Szerkezet

A GFP béta-hordószerkezettel rendelkezik, amely tizenegy a-szálból áll, és alfa-hélixet tartalmaz, amely tartalmazza a kovalensen kötött kromofort 4- (p-hidroxi-benzilidén) imidazolidin-5-on (HBI), amely a középponton keresztül halad. Öt rövidebb alfa -hélix sapkát képez a szerkezet végein. A béta-hordó szerkezete egy majdnem tökéletes henger, 42Å hosszú és 24Å átmérőjű, létrehozva az úgynevezett "?-konzerv" formációt, amely egyedülálló a GFP-szerű családban. A HBI, a Ser65-Tyr66-Gly67 tripeptid spontán módosított formája, nem megfelelően fluoreszkáló a megfelelően hajtogatott GFP állvány hiányában, és főleg nemionizált fenol formájában létezik a wtGFP-ben. A hordó befelé néző oldalláncai specifikus ciklizációs reakciókat indukálnak a Ser65-Tyr66-Gly67-ben, amelyek indukálják a HBI ionizációját a fenolát formába és a kromoforképződést. Ezt a fordítás utáni módosítási folyamatot nevezzük érlelés. A hidrogénkötési hálózat és az ezekkel az oldalláncokkal való elektronhalmozási kölcsönhatások befolyásolják a GFP és számos származéka színét, intenzitását és fotostabilitását. A hordó szorosan csomagolt jellege kizárja az oldószermolekulákat, megvédi a kromofór fluoreszcenciát a víz általi eloltástól.


Vita

A csővezetékünk azt mutatja, hogy a különböző szövetek különböző sejtkörnyezetei hozzájárulnak a különböző fehérje stabilitáshoz és kinetikai fenotípusokhoz. Az eukarióta sejtek citoplazmájának pH -ját, az itt vizsgáltakhoz hasonlóan, szigorúan 7,0 és 7,4 között szabályozzák 19. A közelmúltban kimutatták, hogy a különböző szervezetekben lévő eltérő citoplazmaanyag átmenetileg megtapadhat a fehérje felületén, és nyilvánvaló különbségeket okozhat a fehérje tulajdonságaiban 20 . Ha megfigyeléseink átmeneti tapadási kölcsönhatások eredményeként jönnek létre, a felületi töltés eltávolítása más hatást gyakorolna a különböző sejtes környezetekben. Összehasonlítottuk a PGK és egy felületmódosított mutáns (4. kiegészítő ábra) stabilitását emlős U-2 OS sejtekben és zebrahal myocytában, és azt találtuk, hogy a két PGK variáns közötti stabilitásbeli különbség azonos a két sejttípusban. Ez arra utal, hogy az itt megfigyelt különböző fehérje stabilitás és kinetikai fenotípusok nem a citoplazmatikus tapadás következményei.

A makromolekuláris kiszorítás fokozza a natív állapot stabilitását a kibontott állapothoz képest azáltal, hogy korlátozza a széthajtott fehérje konformációs szabadságát, és enyhén csökkenti a hajtogatási sebességet 21. A PGK in vitro vizsgálatai kimutatták, hogy stabilitása és kinetikája érzékenyebb a zsúfoltságra, mint a nem sztérikus kölcsönhatásokra 15 . A PGK stabilitása és kinetikája független volt a 20 és 200 mM közötti egyértékű só közötti ionerősségtől. A sejtlizátum vagy lízispuffer alacsony koncentrációja stabilizálta a PGK-t, de nem volt hatással a PGK feltekeredési kinetikájára. Míg mind a PGK stabilitása, mind a kinetika érzékeny volt a makromolekuláris kiszorulásra. Ezért a megnövekedett Tm és a szemlencse sejtjeiben megfigyelt lassú kinetika valószínűleg a krisztallin magas koncentrációja okozta zsúfoltság következménye.

A szemlencse nagy részét rostsejtek alkotják, amelyek a differenciálódás során elveszítik organellumokat és sejtmagjukat. Az α-, β- és γ-kristályok nagy koncentrációban expresszálódnak, és a citoplazmában rövid hatótávolságú, üvegszerű sorrendbe rendeződnek, hogy elérjék az átlátszóságot és a fénytörési tulajdonságokat, amelyek szükségesek ahhoz, hogy a fény a retinára fókuszáljon 22. A fejlődés első 3 hetében a zebrafish lencse túlnyomórészt β-kristályokból áll 23. A β-kristályok felületei erősen feltöltöttek, savas és bázikus osztályokra vannak osztva, amelyek homo- vagy hetero-oligomereket alkotnak. Eltekintve a fent tárgyalt makromolekuláris zsúfolt hatásoktól, a β-kristályok közvetlenül kölcsönhatásba léphetnek a PGK-val felületi töltéseik révén, ami előnyös vagy ellentétes lehet a fehérje feltekeredésével. Korábbi, sejtszerű környezetben végzett PGK-vizsgálataink 15 azt mutatják, hogy a PGK-nak a hajtogatása és kinetikája viszonylag érzéketlen az ilyen elektrosztatikus kölcsönhatásokra.

Az izomszövetek hosszúkás, párhuzamos fehérjeszálakat tartalmaznak a mechanikai összehúzódáshoz, míg a keratinociták erősen szabályozzák, védekezéssel, szekrécióval, felszívódással vagy szűréssel reagálnak a külső stresszre. Ezen strukturális és funkcionális különbségek ellenére Tm és a PGK relaxációs ideje hasonló a myocytákban és a keratinocytákban. A PGK a notochordban, amely merev és nagyított vákuum uralja, szintén hasonló Tm. Ezért ezeken a szöveteken a lokális citoplazmatikus feltekeredési környezet hasonló, legalábbis a PGK próbafehérje alapján.

Összefoglalva, egy testreszabott csővezetékről számolunk be, amely lehetővé teszi, hogy összehasonlítsuk ugyanazon fehérje konstrukció viselkedését élő zebrahal differenciált szöveteinek egyetlen sejtjében. Ennek a csővezetéknek az alkalmazását a fehérje stabilitásában, kinetikában és más fehérjékkel vagy biomolekulákkal való kölcsönhatásban tapasztalható helyi különbségek nyomon követésére képzeljük el az élő, átlátszó organizmusokon belül. Várjuk, hogy ez a csővezeték hasznos eszköz lesz a szövetspecifikus hőmérséklet-érzékeny folyamatok, például a hipertermia vagy a fotodinamikus rákterápia 24, vagy a génszabályozás és -funkció 25 megértéséhez.


Biolumineszcencia

A biolumineszcencia az élőlények által a testükben zajló kémiai reakciók által kibocsátott fény.

Biológia, kémia, földtudomány, óceánográfia

Szójegyzék

alkalmazkodni az új környezethez vagy új helyzethez.

mezőgazdasági üzlet

a profitszerzési gyakorlat alkalmazásának stratégiája a gazdaságok és tanyák működésében.

(egyes számban: alga) a vízi élőlények változatos csoportja, amelyek közül a legnagyobbak a hínárok.

(egyes szám: baktérium) egysejtű élőlények a Föld minden ökoszisztémájában.

tudós, aki élő szervezeteket tanulmányoz.

biolumineszcencia

az élőlények által a testükben zajló kémiai reakciók által kibocsátott fény.

taktika, amelyet az élőlények külsejük leplezésére használnak, általában azért, hogy beolvadjanak a környezetükbe.

olyan anyag, amely kémiai reakciót okoz vagy felgyorsít anélkül, hogy az befolyásolná.

az élő szervezet legkisebb működő része.

kémiai reakció

folyamat, amely magában foglalja az érintett anyagok (reagensek) atomjainak, ionjainak vagy molekuláinak megváltozását.

kemilumineszcencia

fénykibocsátás kémiai reakció következtében.

klorofill

növények zöld pigmentje, amely elengedhetetlen a fotoszintézishez.

körülmény

nagyon kis hősugárzást kibocsátó forrás által kibocsátott fény.

legalább két kémiai elemet tartalmazó anyag kémiai kötéssel.

ellenvilágítás

A biolumineszcencia típusa, amelyet az élőlények használnak, hogy elrejtsék az alatta lévő ragadozókat a fenti fénymintákba való bekeveredéssel.

egy állat vagy más szervezet vonzására használt tárgy.

hogy halassza egy későbbi időpontra.

hogy elszakadjon valami mástól.

dinoflagellate

egysejtű tengeri élőlény, amely a plankton fő alkotóeleme.

közösség és az élő és nem élő dolgok kölcsönhatásai egy területen.

elektromosság

az elektromos töltés jelenlétével és áramlásával kapcsolatos fizikai jelenségek összessége.

olyan személy, aki dolgok, például szerkezetek (építőmérnök) vagy anyagok (vegyészmérnök) építését tervezi.

élő sejtekben termelt fehérjék, amelyek katalizátorként működnek, és felgyorsítják a szervezet létfontosságú folyamatait.

hosszú, vékony, húsos növekedés a horgászhal fejéből.

nagyon vékony szál- vagy szálszerkezet.

hogy rövid fénysugarat bocsásson ki.

fluoreszcencia

az anyag fénykibocsátása más fényforrásnak való kitettség során.

egyes gombák által kibocsátott fény a fa korhadása során.

(többes szám: gombák) típusú organizmus, amely túléli a lebomló és felszívódó anyagot, amelyben növekszik.

(zöld fluoreszcens fehérje) vegyi anyag (fehérje), amely élénkzöld fluoreszcenciát mutat, ha a kéktől az ultraibolya tartományig terjedő tartományba esik.

hogy hosszú időn keresztül folyamatos fényáramot bocsátanak ki.

olyan környezet, ahol egy szervezet egész évben vagy rövidebb ideig él.

olyan környezet, ahol egy szervezet egész évben vagy rövidebb ideig él.

a termények gyűjtése és gyűjtése, beleértve a növényeket és az állatokat is.

elektromosan töltött atom vagy atomcsoport, amely úgy jön létre, hogy az atom elektront nyert vagy veszített.

sekély víztömeg, amelynek lehet nyílása egy nagyobb vízfelületre, de homokpad vagy korallzátony is védi tőle.

új vagy éretlen rovar vagy más típusú gerinctelen.

enzim (katalizátor), amely szubsztráttal (luciferin) reagál egy kémiai reakcióban, amely biolumineszcenciát eredményez.

szerves anyagok, amelyek oxidációjuk során gyakorlatilag melegedésmentes fényt termelnek (biolumineszcencia).

egy állat vagy más szervezet vonzására használt tárgy.

köze van az óceánhoz.

biolumineszcens baktériumok jelensége az óceán felszínén.

nyálkás, folyékony váladék egyes állatoknál.

anyag, amelyre a szervezetnek szüksége van az energiához, a növekedéshez és az élethez.

egy tárgy útja egy nagyobb tömegű objektum körül.

élő vagy valaha élő dolog.

foszforeszcencia

hosszan tartó fénykibocsátás a stimuláló fénynek való kitettség és eltávolítás után (beeső sugárzás).

fotoprotein

kémiai anyag (fehérje), amely a luciferinnel és más vegyi anyagokkal kölcsönhatásba lépve biolumineszcenciát hoz létre.

(egyes számban: plankton) mikroszkopikus vízi élőlények.

állat, amely más állatokra vadászik táplálékért.

állat, amelyre más állatok vadásznak és megesznek.

hullámok vagy részecskék formájában kibocsátott energia, amely egy forrásból kifelé sugárzik.

riporter gén

könnyen felismerhető jelenléttel rendelkező gén, amelyet más gének expressziójának és viselkedésének nyomon követésére használnak.

valami más körül keringő tárgy. A műholdak lehetnek természetesek, mint a holdak, vagy mesterségesek.

műholdfelvételek

műholdról vagy műholdról készített fényképek egy bolygóról.

tengeri állat (tüskésbőrű), sok karja sugárzik a testéből. Más néven tengeri csillagnak is nevezik.

anyag, amelyet egy enzim hat kémiai reakcióban.

más szervezetekkel való társulás, nem mindig egyik faj kölcsönös előnyére.

módszere valaminek.

általában a Rák trópusa (23 1/2 fok északra az Egyenlítőtől) és a Bak trópusa (23 1/2 fok az Egyenlítőtől délre) között helyezkedik el.


Nézd meg a videót: Miért ilyen nagy a fehérje doboza (Január 2022).