Információ

Az RNS molekulák megkötik egymást?


Lenne egy kérdésem, talán naiv.

Tegyük fel, hogy RNS-t izoláltunk egy szövetből. Az RNS molekulák képesek -e megkötni egymást, ha rendelkeznek komplementer szekvenciával? Tudom, hogy egyes kis RNS-molekulák képesek megkötni más RNS-eket és szabályozni őket, de nem tudom, hogy ez ebben az esetben lehetséges? Mintha két különböző mRNS köthetné egymást vagy sem?


Az RNS és a DNS közötti különbség meglehetősen kicsi, és mindkettő kettős hélix szerkezetet alkothat. Tehát ha két egymást kiegészítő RNS -szekvenciája lenne egymással, akkor azok bázispárosodnának és spirált képeznének.

Volt néhány ötlet ennek terápiás célokra történő felhasználására is, az antiszensz RNS, egy hírvivő RNS-t kiegészítő RNS oligo, elméletileg használható a génexpresszió elnémítására az mRNS-hez való bázispárosítással.


@MadScientist válasza nagyon jó. Csak egy részletet szeretnék hozzáfűzni, ami nem fér el egy megjegyzésben.

A kettős szálú RNS semmi kivételes. Láthat egy RNS -szálat, amely az antiszenszéhez kötődik például a tRNS -ben és például az RNSi -ben.

tRNS

RNAi


Többdimenziós áthallás az RNS-kötő fehérjék és a nem kódoló RNS-ek között a rákbiológiában

Az RNS-kötő fehérjék (RBP-k) jól ismert, hogy RNS-kötő domének (RBD-k) révén kötődnek az RNS-hez, és fordítva határozzák meg RNS-célpontjaik sorsát és funkcióját, bizonyos RBP-ket bizonyos esetekben módosíthat a kötött Az RNS -ek inkább szabályozzák RNS -partnereiket. A jelenlegi proteóm-szintű tanulmányok azt mutatják, hogy az RBP-k csaknem fele nem rendelkezik kanonikus RBD-vel, és több tízezer nem kódoló RNS (ncRNS) felfedezése, különösen azok, amelyek mérete nagyobb, mint 200 nt (nevezetesen hosszú, nem kódoló RNS-ek, lncRNS-ek), Az RBP-k és az RNS-ek közötti áthallás bonyolultabb. Nyilvánvaló, hogy az RBP és az RNS által alkotott makromolekuláris komplexek nemcsak az RBP és RNS komponensek létezésének egyik formája a sejtekben, hanem egy funkcionális entitás is, amelyen keresztül ezek az RBP -k és szabályozó ncRNS -ek részt vesznek a szervezetben a szabályozó hálózatok felépítésében. Ebben a felülvizsgálatban összefoglaljuk a daganatos RBP -k és ncRNS -ek közötti többdimenziós áthallást, és megbeszéljük, hogy az RBP -k hogyan érik el funkciójukat a kötött ncRNS -eken keresztül a génexpresszió különböző aspektusaiban, valamint azt, hogy az RBP -k hogyan irányítják az ncRNS -ek módosítását és feldolgozását a tumor jobb megértése érdekében biológiát, és új betekintést nyújt a rákterápia és a korai felismerés stratégiáinak kidolgozásába.


Egy korábbi genetikai molekula előállította a DNS -t és az RNS -t?

Az élővilág kémiájában egy pár nukleinsav - DNS és RNS - uralkodik. A genetikai kód hordozómolekuláiként minden szervezet számára biztosítanak egy mechanizmust, amely hűen reprodukálja önmagát, valamint előállítja az élő rendszerek számára létfontosságú számtalan fehérjét.

John Chaput, az Arizonai Állami Egyetem Biodesign Institute® evolúciós orvostudományi és informatikai központjának kutatója szerint azonban nem mindig volt ez így.

Chaput és más kutatók, akik a földi élet első kísérleti villogását tanulmányozták, különféle alternatívákat vizsgáltak az ismert genetikai molekulák helyett. Ezek a vegyi anyagok vonzóak azok számára, akik meg akarják fejteni az első élet kezdetének még mindig megfoghatatlan titkát, mivel a primitív molekuláris formák könnyebben megjelenhettek a bolygó prebiotikus korszakában.

Az RNS és DNS genetikai prekurzoraként funkcionáló molekulák azonosításának egyik megközelítése az, hogy megvizsgálunk más nukleinsavakat, amelyek kémiai összetételükben kissé eltérnek egymástól, de még mindig rendelkeznek kritikus önszerveződési és replikációs tulajdonságokkal, valamint a formába való összehajthatóság képességével. hasznos a biológiai működéshez.

Chaput szerint az egyik érdekes versenyző a korai genetikai hordozó szerepére egy TNA néven ismert molekula, amelynek érkezése az ős színhelyére megelőzhette ismertebb rokonait. A DNS-hez és az RNS-hez egyaránt formailag hasonló nukleinsav, a TNS szerkezetének cukorkomponensében különbözik, és nem dezoxiribózt (mint a DNS-ben) vagy ribózt (mint az RNS-ben) használ a gerincének összeállításához.

A Nature Chemistry folyóiratban ma megjelent online cikkben Chaput és csoportja a funkcionális TNS-molekulák darwini evolúcióját írja le véletlenszerű szekvenciák nagy csoportjából. Ez az első eset, amikor ilyen módszereket alkalmaztak a DNS-től és RNS-től eltérő molekulákra vagy ezek nagyon közeli szerkezeti analógjaira. Chaput szerint „a legfontosabb megállapítás ebből a munkából az, hogy a TNA összetett formákká hajtogatható, amelyek nagy affinitással és specifitással kötődhetnek a kívánt célponthoz”. Ez a tulajdonság azt sugallja, hogy a jövőben lehetséges lehet a TNA enzimek kifejlesztése a korai életformák fenntartásához szükséges funkciókkal.

Szinte minden élőlény a földön DNS -t használ a gének genetikai információinak darabkáinak kódolására, amelyeket aztán RNS -be másolnak. A polimeráz néven ismert speciális enzimek segítségével az RNS aminosavakat állít össze esszenciális fehérjék képzésére. Figyelemre méltó, hogy a genetikai kód alapvető működése ugyanaz marad, legyen az akár csiga, akár szenátor, ami egy közös ősre mutat a DNS-alapú mikrobiális életben, amely már mintegy 3,5 milliárd évvel ezelőtt virágzott.

Mindazonáltal az ilyen ősök ekkorra már meglehetősen összetettek voltak, ami egyes tudósokat arra késztetett, hogy az önreplikáció még korábbi formáiról spekuláljanak. Mielőtt feltűnt volna, hogy a DNS meghatározó szerepet játsszon az élet tervrajzaként, az RNS által uralt egyszerűbb genetikai világ érvényesülhetett. Az ismert RNS -világhipotézis azt állítja, hogy a ribonukleinsav (RNS) a genetikai információk tárolására és a kémiai reakciók katalizálására hatott, hasonlóan a fehérje enzimhez, a DNS, az RNS és a fehérjék előtti korszakban, amelyek az élővilágban ma elterjedt integrált rendszert alkották.

Míg a DNS ikonikus kettős spirálját két, egymást kiegészítő komplementer nukleotidszál képezi, amelyek béléses párosítással, spirális lépcsőn kapcsolódnak egymáshoz, az RNS egyszálú. A két nukleinsav, a DNS és az RNS az egyes molekulák cukor-foszfát gerincét alkotó cukorkomplex típusáról kapta a nevét – egyfajta molekulaszálat, amely összetartja a nukleotid gyöngyöket.

Létezhetett volna egy egyszerűbb, önreplikálódó molekula az RNS előfutáraként, amely talán genetikai anyagot biztosít a Föld legkorábbi élőlényeinek? Chaput kísérletei a TNA nukleinsavval vonzó esetet szolgáltatnak. Kezdetben a TNA tetrózcukrokat használ, amelyeket szerkezetük négy szénatomos gyűrűs részéről neveztek el. Egyszerűbbek, mint a DNS-ben és az RNS-ben található öt szénatomszámú pentózcukor, és könnyebben összeállhatnak egy prebiotikus világban, két azonos két szénatomból álló fragmentumból.

Ezt az előnyt a szerkezeti egyszerűségben eredetileg úgy gondolták, hogy a TNA Achilles -sarka, így kötési viselkedése összeegyeztethetetlen a DNS -sel és az RNS -sel. Meglepő módon azonban a kutatás kimutatta, hogy a TNS egyetlen szála valóban kötődhet mind a DNS-hez, mind az RNS-hez Watson-Crick bázispárosítás révén – ez kritikus jelentőségű tény, ha a TNA valóban létezne olyan átmeneti molekulaként, amely képes információt megosztani egy ismertebb nukleinsavval. savak, amelyek végül uralni fogják az életet.

A jelenlegi tanulmányban Chaput és csoportja a molekuláris evolúció néven ismert megközelítést alkalmazza a TNA genetikai biomolekulaként való potenciáljának feltárására. Az ilyen munka arra a megdöbbentő felismerésre támaszkodik, hogy az alapvető darwini tulajdonságok-az önreplikáció, a mutáció és a szelekció-működhetnek a nem élő vegyi anyagokon.

Ennek a technikának a TNS-re való kiterjesztéséhez olyan polimeráz enzimekre van szükség, amelyek képesek a véletlenszerű DNS-szekvenciák könyvtárát TNS-vé fordítani. A TNA-szálak ilyen készletének létrehozása után a kiválasztási folyamatnak sikeresen azonosítania kell azokat a tagokat, amelyek egy adott funkciót el tudnak látni, a többit kizárva. Vizsgálati esetként a csapat azt remélte, hogy molekuláris evolúció révén olyan TNS-szálat tud előállítani, amely képes nagy specifitású, nagy affinitású kötő receptorként működni a humán fehérje trombin számára.

Először megpróbálták bebizonyítani, hogy a TNA nukleotidok komplementer bázispárosodással kötődhetnek a DNS véletlenszerű szekvenciájához, hibrid DNS-TNA szálat képezve. Egy DNS -polimeráz enzim segítette a folyamatot. Sok véletlenszerű szekvencia azonban a guanin nukleotid ismétlődő szakaszait tartalmazta, aminek az volt a hatása, hogy megszakította a DNS transzkripcióját TNS-vé. Miután a guanin kivételével véletlenszerű DNS-könyvtárakat építettek, nagy hozamú DNS-TNA hibrid szálakat állítottak elő.

A kapott szekvenciák 70 nukleotid hosszúak voltak, ami Chaput szerint elég hosszú volt ahhoz, hogy lehetővé tegyék, hogy meghatározott kötőhelyekkel rendelkező alakzatokká hajtogassák őket. A DNS-TNS hibrideket ezután a célmolekulával, a trombinnal inkubáltuk. A célponttal kötött szekvenciákat kinyerjük és PCR -rel amplifikáljuk. A DNS-részt eltávolítottuk és templátként használtuk a további amplifikációhoz, miközben a nagy affinitású, nagy specificitású kötési tulajdonságokat mutató TNA-molekulák megmaradtak.

Ezenkívül a kialakult és kiválasztott TNS-molekulák kötési affinitását két másik gyakori fehérjével szemben is tesztelték, amelyekhez nem mutattak affinitást, megerősítve azt az esetet, hogy a csoport irányított evolúciós eljárása egy nagyon specifikus kötőmolekulát eredményezett.

Chaput azt sugallja, hogy a ribóz cukrok prebiotikus szintézisével és az RNS nem enzimatikus replikációjával kapcsolatos kérdések közvetett bizonyítékokat szolgáltathatnak egy korábbi genetikai rendszerről, amely könnyebben előállítható primitív földi körülmények között. Bár nehéz bizonyítani, hogy a TNA RNS-prekurzorként működött a prebiotikus világban, Chaput rámutat ennek a molekulának a vonzerejére, mint erős jelöltre, amely képes információt tárolni, szelekciós folyamatokon megy keresztül, és harmadlagos struktúrákká alakul, amelyek képesek összetett feladatok elvégzésére. funkciókat. Ez az eredmény motivációt ad a TNA mint korai genetikai rendszer feltárására.

Chaput optimista, hogy a TNA prebiotikus szintézisével, a földi élet eredetében és korai evolúciójában játszott szerepével, valamint az RNS esetleges genetikai átvételével kapcsolatos főbb kérdésekre idővel választ kapnak.


RNS -ek: Gyűjtsd össze!

Egyes tudósok feltételezése szerint a földi élet egyetlen molekulával kezdődött: ribonukleinsavval vagy RNS -sel. A foszfát-, cukor- és nukleinsavláncokból álló RNS-molekulák létrejöhettek és feloldódhattak az őslevesben, amíg egy önreplikálódó, folyamatosan fejlődő RNS-t nem kaptak, amely az egész élet alapját képezte.

Ezt az elképzelést „RNS -világ” hipotézisnek hívják - és bár vitatott téma, tagadhatatlan, hogy az RNS -molekulák napjaink egyik legdinamikusabb és legsokoldalúbb molekulája az élő szervezetekben. Hírvivőkként szolgálnak, amelyek elősegítik a fehérjék létrehozását DNS-szekvenciákból, szabályozzák, hogy mennyi ideig maradhatnak más molekulák a sejtekben, képesek katalizálni a fehérjék közötti reakciókat, összehozva a különböző szereplőket egy cél elérése érdekében, és ami fontos, más RNS-ekkel és fehérjék, amelyek elősegítik a sejtfolyamatokat.

A DNS, az RNS kettős szálú unokatestvére, elsősorban a szekvenciája miatt fontos. Az RNS -nek is van szekvenciája, de az egyik ok, amiért ezek az apró molekulák sokféle funkciót töltenek be a sejtben, fizikai tulajdonságaiknak köszönhető. Valójában a tudósok több ezer RNS-ről tudnak, amelyek nem kódolnak egyetlen fehérjét sem (sok célja még mindig ismeretlen).

"Az RNS -ek önmagukhoz kötődve másodlagos struktúrákat hozhatnak létre, kötődhetnek más RNS -ekhez, hogy harmadlagos struktúrákat hozzanak létre, annyi különbség van az egymással való interakcióban - és ennek nagy része nem szekvencia -specifikus" - mondja Ruth, a Whitehead Intézet igazgatója Lehmann. "Ezért vannak, akik az RNS -eket az RNS -világ középpontjába helyezik."

Ebben a cikkben a szekvencián túlmenően megpróbáljuk feltárni az RNS kémiai és fizikai tulajdonságait, és azt, hogy ezek a tulajdonságok hogyan teszik lehetővé, hogy más RNS-ekkel csoportosuljanak, hogy elősegítsék a sejtműködést – vagy betegséget okozzanak.

Ragadós szalagmolekulák


Ahhoz, hogy megértsük, hogyan csoportosul az RNS a sejtben, segít megérteni az RNS -molekulák alapvető tulajdonságait. Ellentétben a DNS -sel, amely két összefonódó szálból áll, az RNS egyszálú molekula. A molekula gerincét váltakozó cukor- és foszfátcsoportok alkotják, a másik oldal pedig – a „ragadós oldal” – az adenin, a guanin, a citozin és az uracil nukleinsavait tartja, mint a fésű fogai.

Képzelje el, hogy hosszú szalagot tart a kezében. Ha összehozza a kezét, láthatatlan erők húzzák magukba azt a szalagdarabot, és csavarja össze a hurkokat. Nagyjából ez történik a sejtben lévő RNS-szálakkal, mondja Ankur Jain, a Whitehead Intézet tagja. "A nukleinsavak bázispárokat képezhetnek, A bázikus párokat U -val, G bázisokat C -vel" - mondja Jain. "Sok -sok olyan hely van, ahol egyetlen RNS -molekula képes önmagához kötődni."

Ez az önkötés az RNS „másodlagos szerkezetéhez” vezet, ami szükséges a sejtben lejátszódó egyes folyamatokhoz. Bár ezeknek a struktúráknak a kialakulása az RNS nukleotidszekvenciájának köszönhető, a struktúra kialakulása után önálló életet kezdenek. Egyes RNS-ek, úgynevezett ribozimek, hasznos formákká hajtogatnak, amelyek elősegítik a sejtben zajló kémiai reakciókat.

Amikor a jó RNS elromlik

Ugyanazok a tulajdonságok, amelyek az RNS -t tökéletessé teszik a hasznos másodlagos struktúrák létrehozásához, néha szerepet játszhatnak a betegségekben - különösen akkor, ha a DNS mutációi számos ismétlődő szekvenciához vezetnek. Ankur Jain azt vizsgálja, hogy mi történik, ha ez a fajta mutáció, amelyet ismétlődő expanziónak neveznek, előfordul az emberi szervezetben.

Ismétlődő kiterjesztések történhetnek DNS replikációs hibákon keresztül különböző rövid ismétléseken, amelyek az emberi genomot almozzák. Ez a mutációs forma a DNS érintett szakaszát sokkal hosszabbá teszi, mint korábban. Ez viszont nagyon hosszú RNS -molekulákhoz vezet a DNS átírásakor.

Ezek a szuperhosszú RNS-ek ragacsosak, akárcsak a hagyományos RNS-ek – az extra tömegtől eltekintve könnyen összegabalyodhatnak. „Ugyanaz a fizikai elv, amely szerint a haj vagy egy hosszú, hajlékony kötéldarab összekuszálódik, itt molekuláris szinten alkalmazzák” - mondja Jain.

Ezek a gubancok összetapadhatnak, és káros, visszafordíthatatlan aggregátumokat képezhetnek. "Ezek az RNS -aggregátumok felhalmozhatják a sejtfehérjéket" - mondja Jain. "Szivacsdarabokként viselkednek, és más fehérjéket kötnek le a sejtben."

Ez mindenféle problémához hozzájárulhat a sejtműködésben - és amikor RNS -aggregátumok fordulnak elő az idegrendszer sejtjeiben, hozzájárulhatnak olyan betegségekhez, mint az ALS, a Huntington -kór és a Fragile X -szindróma. Jain és laboratóriuma azt vizsgálja, hogy ezek az aggregátumok hogyan játszhatnak szerepet a betegségekben, és keresik a módját, hogy megzavarják vagy feloldják őket a sejtekben.

A toll RNS -jei…

Míg ezek az irreverzibilis RNS -aggregátumok károsak lehetnek a sejtekre, létezik egy másik típusú csoportosítás is, amely RNS -eket foglal magában, és valójában nagyon szükséges ahhoz, hogy a sejt elvégezze a funkciókat, például az átírást. "Az RNS önszerelésének másik oldala ezek a nem membránhoz kötött testek a sejtben, amelyek RNS-t és RNS-kötő fehérjéket tartalmaznak"-mondja Jain.

Ezek a csoportok, amelyeket kondenzátumoknak neveznek, kicsi, membrán nélküli organellák, amelyek gyorsan és könnyen kialakulhatnak és feloldódhatnak, ellentétben a Jain által vizsgált káros aggregátumokkal. A kondenzátumok gyakran RNS-ekből, RNS-kötő fehérjéknek nevezett fehérjékből és egyéb sejtkomponensekből állnak, amelyek a kondenzátum funkciójától függően különböznek egymástól. A tudósok ezeket a kondenzátumokat egy pohár vízben lévő olajcseppekhez hasonlították.

Az elmúlt évtizedekben a kondenzátumokra vonatkozó új információk alakították ki a sejtbiológia megértésének módját. Sok diák megtanulta a sejt belsejét egyfajta levesként, a sejtfunkciókhoz szükséges összes összetevőt összekeverve és egyenletesen elosztva a citoplazmában. A tudósok mára felismerték, hogy a sejt folyamatosan kondenzátumokat hoz létre és old fel annak érdekében, hogy olyan speciális funkciókat hajtson végre, mint a transzkripció, az RNS-splicing vagy a riboszómák létrehozása.

A Whitehead Intézetben számos laboratórium működik, amelyek különböző típusú kondenzátumokat vizsgálnak. 2018-ban a Whitehead Intézet tagja, Richard Young és laboratóriuma felfedezett egy újfajta cseppecskét, amelyet transzkripciós kondenzátumnak neveznek. Ezek az új kondenzátumok egyesítik a gén sikeres átírásához szükséges különböző fehérjéket.

Két évvel később, 2020 -ban a Young labor érdekes dolgokat fedezett fel az RNS ezekre a kondenzátumokra gyakorolt ​​hatásával kapcsolatban: maguk az RNS -molekulák - a transzkripció termékei - felelősek azok kialakulásának visszacsatolási hurokon keresztül történő szabályozásáért. Túl kevés RNS -molekula, és a sejt transzkripciót kezdeményez, hogy többet hozzon létre. Túl sok, és az átírás leáll.

Ez a viselkedés független volt az RNS -molekulák szekvenciájától, helyette egy másik tulajdonságuktól: a töltésüktől függött. Míg az RNS-molekula egyik oldala tartalmazza a nukleotidokat, a másik oldala váltakozó cukor- és foszfátmolekulák „gerincéből” áll. Sok RNS kölcsönhatás a molekula ezen részének köszönhető, amely rendkívül negatív töltést hordoz.

"Sok fehérje, a biológiában meglévő pH -n, nettó pozitív töltéssel rendelkezik" - mondja Young. „És emiatt hajlamosak taszítani egymást. De ha van egy másik polimerje, mint például az RNS, amely csak egy sor negatív töltés, akkor semlegesíti ezt a taszítást, és segít összeállni. Ahol az RNS egyensúlyba hozza a fehérjék nettó pozitív töltését, ott éri el a maximális mennyiségű kondenzátum képződését.”

Young ezt ahhoz hasonlítja, ahogyan a viharban kialakul a villám. A viharfelhő alja tele van negatív töltésekkel, alatta pedig a talaj pozitívabb – és a töltés kiegyensúlyozása érdekében sok negatív töltés egy recsegő csavarként egyesül, hogy találkozzon a talaj pozitív töltéseivel.

Ha az RNS-t a szekvencia helyett a töltésben gondolják, Young és laboratóriuma arra késztette a kérdést, hogy vajon a genomban kódolt RNS-ek némelyike, amelyek nem kódolnak fehérjéket, esetleg szerepet játszanak-e a kondenzátumok szabályozásában.

„Jelenleg az a nagy kérdésünk, hogy mi a funkciója a hosszú, nem kódoló RNS-eknek a sejtekben? Young azt mondja. „A kutatók úgy gondolták, hogy soknak nincs funkciója, de most azt képzeljük, hogy ezek az RNS -ek a transzkripciós kondenzátumokat hangolják azokon a genomi helyeken, ahol átírják őket. Éppen most kezdjük a munkát ezen.”

Partner fehérjék

Míg Young laboratóriuma a transzkripciós kondenzátumokra összpontosít, a Whitehead Intézet igazgatója, Ruth Lehmann egy másik típusú kondenzátumot vizsgál, amelyet csíraszemcséknek neveznek. A különféle RNS- és fehérjemolekulákból készült szemcsékről úgy gondolják, hogy szabályozzák a hírvivő RNS-molekulák (mRNS) transzlációját a csírasejtekben – a petesejteket és spermiumokat termelő sejtekben – a fejlődés során.

Lehmann először a csíraszemcsék iránt érdeklődött az embriók mintázatát befolyásoló géneken végzett diplomamunkája során.Észrevett néhány olyan fehérjét a csírasejtekben, amelyek nélkülözhetetlenek az embrió megfelelő kialakulásához – és egy különösen fontosnak tűnt a tojás két „pólusa” közül az egyik létrehozásában (ezek a pólusok elölről hátul térben helyezik el tervrajz az embrió későbbi fejlődéséhez).

Néhány kísérlet elvégzése után rájött, hogy ez a fehérje, amelyet Oskarnak nevezett, egy RNS -kötő fehérje, amely a csíraszemcsék életét szolgálta, ha Lehmann megváltoztatta az Oskar fehérjét, így az a csírasejt ellenkező oldalán gyűlt össze, az összes többi „bulivendég” – a csírasejtek működéséhez nélkülözhetetlen RNS-ek és fehérjék – következett.

Mint kiderült, Oskar a csíraszemcsék „mag” fehérjéül szolgál, néhány specifikus RNS -t és más RNS -kötő fehérjét kötve, amelyek viszont több fehérjét kötnek és más RNS -eket vonzanak. A kondenzátum képződésének ez a mechanizmusa a kondenzátumképzés egy másik módszerét mutatja, amelyben az RNS-töltés továbbra is szerepet játszik, de olyan fehérjék segítik, mint az Oskar.

„Ruth csírasejtrendszerében az a szép, hogy a fehérjék, amelyeket tanulmányozott, segítenek a fejlődő embrió egyik pólusának felállításában – és Oskarnak van egy RNS-kötő doménje, amely számos RNS-t köt meg azon a helyen, és ezen a mechanizmuson keresztül kondenzátumot képez. - mondja Young. "Tehát legalább két mechanizmus létezik: az egyik specifikus RNS -kötő fehérjéket tartalmaz, a másik pedig a fehérjék és az RNS töltéselosztott tulajdonságait."

A transzkripciós kondenzátumok és a csíraszemcsék nem az egyetlen kondenzátum, amely a sejtekben képződhet. A Whitehead Intézet tagja, David Bartel például egy másik típusú kondenzátumot tanulmányoz, amelyet P granulátumnak neveznek. A kutatók még mindig új szerepeket fedeznek fel az RNS számára a kondenzátumok képződésében.

A Whitehead Intézet saját „RNS világa”

Az elmúlt néhány évben a Whitehead Intézet némileg RNS hotspot lett. Silvi Rouskin Whitehead-ösztöndíjasnak a másodlagos szerkezettel kapcsolatos munkáitól kezdve egészen David Bartelnek a kis RNS-ekre, az úgynevezett mikroRNS-ekre való összpontosításáig, az Intézet kutatói számos szemszögből foglalkoznak az RNS-sel és a kondenzátumbiológiával kapcsolatos kérdésekkel.

„Annyi szinergiára támaszkodhatunk a Whitehead Institute-nál” – mondja Ankur Jain. „Például Silvi laborja az RNS szerkezetét tanulmányozza, és ha máshol lennék, nagyon nehéz lett volna elfogadnom az RNS -aggregátumok tanulmányozására szolgáló technológiáit. De most a laboratóriumom diákjai csak sétálhatnak a laboratóriumába, és megtanulhatják azokat a trükköket, amelyekkel in vivo tanulmányozta szerkezetét. Tényleg stimuláló az RNS -kutatás élvonalába kerülni. ”


Diákoknak és tanároknak

Csak tanároknak

TARTÓS MEGÉRTÉS

Az élő rendszerek egymásra épülő strukturális szintek hierarchiájába szerveződnek.

TANULÁSI CÉL

LÉNYEGES TUDÁS

A hidrolízist és a dehidratációs szintézist a monomerek közötti kovalens kötések hasítására és kialakítására használják.

KIZÁRÓ NYILATKOZATOK

A specifikus nukleotidok és aminosavak molekuláris szerkezete kívül esik az AP vizsga keretein.

Az egyes szénhidrát polimerek molekuláris szerkezete túlmutat az AP vizsga keretein.


Intracelluláris RNS-követő módszerek

Az RNS-követés lehetővé teszi a kutatók számára, hogy vizualizálják az RNS-molekulákat a sejtekben és szövetekben, és fontos tér-időbeli információkat szolgáltatnak az RNS-dinamikáról és -funkcióról. Olyan módszerek, mint a fluoreszcens in situ A hibridizáció (FISH) és a molekuláris jelzők komplementer oligonukleotidokra támaszkodnak az endogén átiratok címkézésére és megtekintésére. Más módszerek mesterséges kiméra transzkriptumokat hoznak létre bakteriofágból származó burokfehérjékkel (például MS2, λN) kapcsolva, hogy megjelöljék a molekulákat élő sejtekben. Más megközelítések szerint az endogén RNS -eket nem katalitikus Cas fehérjékkel komplexált komplementer RNS -ek ismerik fel. Minden technika saját erősségekkel és korlátokkal rendelkezik, amelyeket figyelembe kell venni a kísérlet tervezésekor. Itt a mechanizmusokat, előnyöket és gyengeségeket tárgyaljuk in situ hibridizáció, molekuláris jelzőfények, MS2-címkézés és Cas-eredetű rendszerek, valamint az RNS-követés hogyan használható a molekuláris biológia különböző aspektusainak tanulmányozására.

1. Bemutatkozás

Az RNS-molekulák sokféle szerepet töltenek be a sejtben. A kódoló RNS-ek (messenger (m)RNS-ek) templátként szolgálnak a fehérjék transzlációjához, míg a nem kódoló RNS-ek (beleértve a mikroRNS-eket (miRNS-ek) és a hosszú, nem kódoló RNS-ek (lncRNS-ek)) számos szinten szabályozzák a génexpressziós programokat [1,2]. Az RNS -ek szabályozzák a sejtek metabolizmusának minden aspektusát, és így kimutatták, hogy elengedhetetlen szabályozói a fiziológiai és betegségfolyamatoknak [3,4].

Az RNS-biotechnológia közelmúltbeli fejlődése lehetővé tette a kutatóknak, hogy kikérdezzék a transzkriptumot tömegesen. A mikrotömbök gyors és költséghatékony módszerek az RNS-szintek számszerűsítésére különböző populációkban, és az RNS-szekvenálás (RNA-seq) tovább tisztázza az RNS-ek azonosságát sejt- vagy szöveti szinten [5–7]. A natív vagy keresztkötéses ribonukleoprotein (RNP) komplexek (RIP és CLIP) immunprecipitációja (IP) tovább tudja azonosítani egy adott RNS-kötő fehérje célpontjait, és betekintést nyújt az RNS-fehérje kölcsönhatásokba [8]. Ezek a módszerek átalakították az RNS mezőt. Azonban ezen technikák egyike sem ad információt az RNS térbeli vagy időbeli dinamikájáról a sejtben, beleértve a helyét az RNS feldolgozása, szállítása, tárolása, transzlációja vagy lebontása során. E paraméterek tanulmányozásához a kutatóknak valamilyen módon meg kell jelölniük az érdeklődésre számot tartó RNS-t, és mikroszkóppal elemezniük kell.

Az RNS lokalizációjának fejlődése szubcelluláris szinten javította a vírusos és neurodegeneratív betegségek megértését az RNS által közvetített kóros mechanizmusok jellemzése révén. Például a hepatitis C vírus (HCV) RNS kereskedelmének elemzése során kiderült, hogy a gazdasejtek növelik az I. típusú interferonok termelését azáltal, hogy a vírusos RNS-eket exoszómákba csomagolják, majd ezeket a közeli dendritikus sejtekbe szállítják, aktiválva a TLR-7 által közvetített vírusellenes vírusokat. válasz [9]. Más tanulmányok azt mutatták, hogy az atommagból származó RNS -exportot gátolta a toxikus fehérjeaggregátumok képződése [10], ami megfigyelés például az Alzheimer -kór és a Huntington -kór szempontjából is releváns lehet, mivel mérgező fehérjék felhalmozódása vezérli őket [11]. .

Az RNS lokalizációja szintén fontos a sejtpolaritás és aszimmetria kialakításához a fejlődés során. A fejlődési mintázatot úgy érjük el, hogy az mRNS transzlációt a sejt egyik oldalára korlátozzuk, hatékonyan lokalizálva a megfelelő fehérjetermékeket a szubcelluláris rekeszekhez. Ez nyilvánvaló a Drosophila petesejtek, amelyek szabályozása bicoid Az mRNS lokalizációja fej- és mellkasi régiókat hoz létre a tojásban [12]. Hasonló mechanizmusokat azonosítottak a Xenopus és a zebrahal fejlődése [13,14].

Felnőtt emlősökben a hosszú távú mRNS transzport egyik figyelemre méltó példája a neuronokban található hírvivő ribonukleoprotein (mRNP) granulátum formájában [15]. Ezeket az mRNP -granulátumokat „transzlációs hotspotokban” tárolják az idegsejteken belül [16]. Az idegi depolarizáció a tároló granulátumok mobilizálását váltja ki, hogy aktívan transzláló poliszómákat képezzen [17]. Az mRNP komplexek komplex biológiai szerepeit az elmúlt 20 évben tanulmányozták, feltárva fontos összefüggéseket az idegsejtek túlélésével és működésével [15,18,19].

A sejtes RNS lokalizációjának és transzportjának tanulmányozására az RNS követésének számos módszerét dolgozták ki, amelyek forradalmasították a területet. Ez az áttekintés konkrétan leírja a legnépszerűbb technikákat, és bemutatjuk az endogén RNS-ek fluoreszcens oligomer címkék (fluoreszcens) használatával történő megjelölésének módszereit. in situ hibridizáció (FISH)) vagy beaconok, az egyes RNS-ek nyomon követésére olyan kiméra RNS-ek létrehozásával, amelyek nyomon követhető elemeket tartalmaznak (pl. MS2, boxB, RNS-aptamerek), valamint endogén RNS-ek azonosítására egy nem katalitikus Cas9/Cas13-mal komplexált komplementer RNS-en keresztül (1. táblázat). Azt is megvitatjuk, hogy ezek a technológiák hogyan segítenek a fontos RNS-biológia megértésében.

1. táblázat: Az RNS követési technikák áttekintése. Az RNS FISH antiszensz oligomereket alkalmaz fluoroforokhoz konjugálva, hogy nyomon kövesse a céltranszkripteket rögzített sejtekben. A molekuláris jelzőfények elvileg hasonlóak, de a kioltó hozzáadása csökkenti a nem kötött szondák háttérzajt, javítva azok hasznosságát az élő sejtes kísérletekben. Az MS2 címkézés és hasonló aptamer-alapú módszerek egyedi szekvenciák (MS2 hajtű, RNS aptamer szekvenciák stb.) Klónozását foglalják magukban az érdeklődő átirat 3'UTR-jébe, ezt a szekvenciát ezután felismeri és megköti egy fluoreszcensen címkézett fehérje vagy más molekula élő segítségével vagy rögzített cellák. Az RNS követése Cas fehérjékkel katalitikusan inaktív Cas fehérjéket használ fluoreszcens fehérjével. Ezek a fluoreszcens fehérjék az alkalmazott Cas fehérjétől függően az sgRNS -célzás alapján azonosítják a cél -RNS -eket, szükség lehet további PAMmers nevű oligomerekre is.

2. RNS fluoreszkáló in situ hibridizáció (RNS FISH) és RNS -jelzők

In situ A hibridizáció egy erőteljes molekuláris biológiai technika, amely az 1960-as években történt debütálása óta mindenütt jelen van a nukleinsavkutatás területén [20]. Az antiszensz oligonukleotidok (ASO -k) autoradiográfiás címkével, például 3H vagy 32P lehetővé tették a kutatók számára, hogy olyan oligonukleotidokat vagy DNS -szekvenciákat célozzanak meg, amelyek kiegészítik az oligomert, lehetővé téve e szekvenciák vizualizálását rögzített sejtekben vagy szövetekben [21]. Az évek során ez a technika az új kimutatási módszerek bevezetésével fejlődött ki, mint például az aranycímkézés elektronmikroszkópiával vagy enzimhez kapcsolt kromogén riporterekkel együtt [21].

2.1. RNS FISH

A FISH -t 1980 -ban vezették be a van Duijin laboratóriumban [22], és széles körben alkalmazták a nukleinsavak lokalizációjának tanulmányozására a fejlődés során, a vírusfertőzéshez és más sejtes és molekuláris válaszokhoz. Kezdetben olyan genomiális DNS-régiók azonosítására fejlesztették ki, amelyek specifikusan komplementerek voltak a szintetikus antiszensz-RNS próbákkal (1. ábra)a), a FISH-t hamarosan adaptálták különféle típusú RNS-molekulák kimutatására [23–25]. Az RNS FISH technológia kulcsfontosságú előrelépése az egymolekulájú FISH (smFISH) kifejlesztése volt, ahol több egymást követő fluoreszcens szonda hibridizálja az RNS-t „csempézett” módon, és több próba jelenléte felerősíti a jelet (1. ábra).b) [26]. Ez a technika különösen hasznos az alacsony példányszámú transzkriptumok kimutatására, mivel az átirathoz kötött nagy számú próba egyetlen RNS-molekulát képes megvilágítani több fluorofórral.

1. ábra: RNS FISH. (a) Rövid oligomereket szintetizálunk egy célzó szekvenciával, amely antiszensz az érdeklődő RNS -nek. Az antiszensz oligomerek (ASO-k) fluoreszcens festékekkel vannak konjugálva, amelyek konfokális vagy fluoreszcens mikroszkóppal gerjeszthetők. Jelenleg az RNA FISH oligomerek különböző ASO-k „koktéljaként” állnak rendelkezésre, amelyek képesek a cél RNS-t. (b) Az ASO -k hibridizálnak a cél -RNS -sel az antiszensz célzási szekvenciával. Az érdeklődésre számot tartó RNS ASO-kkal történő bevonásával a jel felerősödik, hogy megkönnyítse az alacsony kópiaszámú vagy diffúz transzkriptumok kimutatását a sejtben. (c) Példa RNS FISH-ra HeLa sejtekben, konfokális mikroszkóppal leképezve (nem publikált kép a szerzőktől). GAPDH A Quasar 670 ASO -kkal jelölt mRNS -t (világoszöld) detektálják a citoplazmában. MALAT1 (piros), Quasar 570 ASO -kkal megjelölve, nukleáris pöttyökben található.

Míg az RNS FISH lehetővé teszi az RNS -molekulák nyomon követését a sejtekben, értékes eszköz a cél -RNS térbeli eloszlásának és kópiaszámának számszerűsítésére is. Az RNS-seq és a reverz transzkripció (RT), majd a valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (qPCR) vizsgálatokkal közvetlenül lehet számszerűsíteni a transzkriptumot szövetekben vagy egyes sejtekben [6, 27, 28], de jellemzően nem adnak tájékoztatást a lokalizációról és az expresszióról. specifikus RNS-t a szubcelluláris kompartmentekben, például a sejtmagban. Így az RNA FISH általi számszerűsítés egyedülállóan hasznos a példányszám és a hely meghatározásához. Napjainkban az RNS FISH az RNS lokalizáció egyik aranystandardja.

A FISH megjelenésétől kezdve a sejtes RNS -kereskedelem tanulmányozására használják. Egyén FISH elemzése β-aktin (ACTB) mRNS-ek kimutatták, hogy a fibroblasztok vezető lamelláiban való lokalizációjuk hozzájárul a sejtmotilitáshoz [29]. Hasonlóképpen, β-aktin Az mRNS-transzport az irányítószám-kötő protein 1-en keresztül az idegi növekedési kúpokban szabályozza az axonnövekedés irányát, amint azt a FISH immunfestéssel párosította [30]. A fent említett kísérleteket, amelyek a HCV RNS kereskedelmét [9] és a nukleáris RNS export gátlását [10] foglalták magukban, szintén FISH segítségével végezték.

Az RNS FISH multiplexelhető azonos azonos mintában lévő különböző átiratok azonosítására. Kosman és munkatársai [31] ezt a módszert használták öt egyedi átirat lokalizációjának észlelésére Drosophila embriók. Ennek a megközelítésnek a fő korlátja a rendelkezésre álló mikroszkópszűrők száma, mivel az egyes fluoroforok emissziós spektruma egyedi. Bár a FISH módszerek ideálisak in situ fix minták elemzésével nem alkalmasak az RNS élő sejtekben történő megjelenítésére. A minták rögzítésének szükségessége az elemzéshez lehetetlenné teszi a szubcelluláris RNS dinamikájának valós idejű tanulmányozását. Ezenkívül a minták erős vegyszerekkel, például paraformaldehiddel vagy sósavval történő rögzítése és előkészítése biokémiai elváltozásokhoz vezethet a sejtekben, megzavarhatja a sejtszerkezeteket vagy denaturálhatja a fehérjéket és az organellákat [32]. Ezen aggodalmak enyhítése és az élő sejtek elemzésének lehetővé tétele érdekében olyan molekuláris jelzőfényeket fejlesztettek ki, amelyek FISH -hoz hasonló módszereket alkalmaznak az RNS megjelenítésére rögzített és élő sejtekben.

2.2. RNS molekuláris jelzők

A molekuláris jelzőfények alapelve ugyanaz, mint a FISH esetében: olyan fluoreszkálóan jelzett oligókat kell alkalmazni, amelyek a sejtben komplementer transzkriptumokat kötnek. A fő különbség abban rejlik, hogy a fluorofort egy kioltóhoz kapcsolják [33]. A kioltók olyan vegyületek, amelyek elnyelik a fluorofor által kibocsátott energiát, és fény helyett hőként disszipálják, drámaian csökkentve a nem kötött szondák háttérjelét [33]. A molekuláris jelzőfények leggyakrabban használt formája a szárhurok (2a) [34]. A célszekvencia (15–20 nts) egy hurkot képez, amelyet mindkét végén palindrom szekvencia szegélyez, az 5′ vég gyakran fluoroforhoz van konjugálva, míg a 3′ véghez egy kioltó kapcsolódik [33]. Ha a jelzőlámpa nem kötődik komplementer célponthoz, a palindromikus szekvenciák hajtűszárat alkotnak, ami a fluorofort és a kioltót elég közel hozza ahhoz, hogy a kioltó elnyomja a fluoreszcenciát, azonban a célszekvenciához való kötődés következtében a hajtű és a hozzá kapcsolt fluorofor és kioltó különálló, ami fluoreszcencia kibocsátását eredményezi (2. ábrab) [33]. A jel hiánya, amikor a jelzőfények nincsenek kötve, csökkenti a zajt. Így az élő sejtekbe beaconokat lehet bevinni, lehetővé téve az RNS-célpontok valós időben történő megfigyelését. Mivel az RNS-célpontokat antiszensz fluorofor-címkézett oligomerek kötik, lehetséges a molekuláris jeladókkal való multiplexelés [35]. A jelzőlámpák elektroporációval, mikroinjekcióval, toxin által közvetített membrán permeabilizációval vagy akár nehézfém bioballisztikus gázpisztolyokkal is bejuttathatók a sejtekbe. Mindegyik módszernek megvannak a sajátos korlátai, de együttesen lehetővé teszik az RNS vizualizációját különböző sejtmodellekben [36,37].

2. ábra Molekuláris jelzőfények. (a) A leggyakoribb molekuláris irányjelző szerkezet egy szár-hurok stílusú szonda. A szár-hurok szerkezete közel hozza a fluoreszkáló festéket a kioltó molekulához. Ez a kioltó elnyeli a festék által kibocsátott energiát, és hőként szabadítja fel, csökkentve a fluoreszkáló háttérzajt. A hurok tartalmazza a célzási szekvenciát, amely hibridizál a kérdéses RNS -sel. (b) A hajtű disszociál, amikor a célzó szekvencia hibridizál a cél RNS -sel. Ez az elválasztás a fluoreszcens festéket a kioltó tartományán kívülre helyezi, lehetővé téve kimutatható fluoreszcencia kibocsátását.

2.3. RNSscope

Míg az RNS vizualizációt általában használják az alapvető orvosbiológiai kutatásokban, ezeket a technikákat nem használják széles körben a diagnosztikában, ahol az RT-qPCR elemzést részesítik előnyben az onkogén vagy vírusos átiratok kimutatására [38]. A fentiekben leírtak szerint azonban a PCR-alapú megközelítések nem rendelkeznek térbeli felbontással, és érzékenységüket heterogén szövetminták megzavarhatják. Az RNSscope -ot az RNS -észlelés diagnosztikai képességeinek javítására fejlesztették ki. A technika az egymolekuláris FISH javulását jelenti, amely megkönnyíti az alacsony példányú átiratok kimutatását a szövetmintákban [39]. Bár RNS-t detektáltak paraffinba ágyazott szövetmintákban, az alapvető sejt- és molekuláris kutatásokhoz is alkalmazható.

Ahelyett, hogy fluoroforhoz közvetlenül konjugált antiszensz oligomereket használnánk, az RNAscope úgy erősíti a fluoreszcenciát, hogy először egy állványt szerel fel a kérdéses RNS-re, amelynek alapja Z alakú próbákból áll (3. ábra). Ezek a próbák 18–25 nukleotidból álló célszekvenciával rendelkeznek, amelyek komplementerek a célponttal. Ehhez a próbához egy spacer szekvencia kapcsolódik, amely egy 14 nukleotid hosszú farokszekvenciához kapcsolódik. A célzó szekvenciákat úgy terveztük meg, hogy két próba egymás mellett közvetlenül hibridizálódjon, a két farok egy folyamatos 28 nukleotidból álló hibridizációs helyet képez. A kapcsolt farok egy, az előerősítő által felismert és megkötött szekvenciát alkot, amely egy gerincszerű szerkezet, amely 20 kötőhelyet tartalmaz. Ezek a kötőhelyek kiegészítik az erősítőket, amelyek rögzítik és kiegészítik az állványt. Az erősítők bekötése után akár 20 festékmolekula is megkötheti az egyes erősítőket, hogy robusztus fluoreszkáló jelet állítson elő a sejtben vagy szövetben [39]. Tekintettel arra, hogy sok elterjedt festék, mint például az Alexa 488 vagy az Alexa 647, kompatibilis az RNAscope-pal, a képalkotás a legtöbb fluoreszcens vagy konfokális mikroszkóppal elvégezhető.

3. ábra. RNAscope szonda kialakítása. Két Z-alakú próba megköti a szomszédos szekvenciákat a kérdéses RNS-en, platformszerű struktúrát alkotva a farokszekvenciákon keresztül. Itt az előerősítő kötődik, és csak akkor kötődhet, ha két Z szonda van kötve. Az erősítők megkötik az előerősítőt, és támasztékként szolgálnak a fluoreszcens szondák megkötéséhez. A Z szondák mindegyike kötőhelyeket biztosít több száz fluoreszcens szonda számára, drámaian felerősítve a fluoreszcenciát egyetlen molekulán. A Z -szondák egy RNS -molekula mentén mozgathatók, hogy tovább javítsák a kimutatást.

A Z próbáknak közvetlenül a céltranszkriptum mellett kell kötődniük ahhoz, hogy teljesen összeállítsák az RNAscope vázat, csökkentve a háttér fluoreszcenciáját és jelentősen javítva a jel-zaj arányt. Ezen túlmenően egy Z-próbakészlet akár 400 színezéket is tartalmazhat, ezért több Z-szonda tervezése az érdeklődésre számot tartó RNS bevonására drámaian megnöveli az egyes RNS-molekulák kimutatásának képességét. Amikor ritka vagy izolált átiratokat észlel nagy szöveti metszetekben, az RNSscope szondák egy halmaza erős jelzést nyújt a kimutatáshoz, ezzel szemben a standard RNS FISH oligomerek cseréjét igényli, ami azt jelenti, hogy egyetlen cél RNS -hez tucatnyi oligomer szekvenciát kell megtervezni. A kérdéses RNS hosszától függően előfordulhat, hogy ez nem is lehetséges, így az RNAscope alkalmasabb megközelítés.A Z-szonda célzási szekvenciáinak rövid hossza (két 18–25 bp-s szekvencia) alkalmassá teszi őket miRNS-ek, esetleg kör alakú RNS-ek célzásához. Az RNSscope akár négy független célpontra is multiplexelhető egyetlen mintában [39], amelyet elsősorban a rendelkezésre álló festékek száma korlátoz. Ezt a technikát azonban elsősorban szövetekben való felhasználásra tervezték, és mint ilyen, jelenleg csak paraffinosított mintákban használható.

3. Bakteriofágból származó RNS-címkék

Az eddig leírt módszerek az oligomerek és a cél-átirat komplementer bázispárosításán alapulnak. Ezeknek a megközelítéseknek az egyik hátránya, hogy ha a célszekvencia nem érhető el, akár azért, mert hajtűbe van ágyazva, más nukleinsavhoz kötődik, vagy RNS-kötő fehérjéhez (RBP) kapcsolódik, akkor nem fordulhat elő hibridizáció [40]. Ezenkívül az endogén transzkriptumok bősége alacsony lehet, ami tovább korlátozza a megközelítés érzékenységét. E korlátok leküzdésére a kutatók bakteriofágból származó RNS-címkén alapuló jelölési rendszereket fejlesztettek ki, hogy tanulmányozzák az egyedi RNS dinamikáját élő sejtekben. Először élesztőben mutatták be [41], a technikát a sejten belüli RNS mobilizáció és a különböző sejtekkel való kölcsönhatás tanulmányozására fejlesztették ki. ford-cselekvő tényezők, beleértve az RBP -ket, a miRNS -eket és az lncRNS -eket [42,43].

3.1. MS2/MS2-BP és boxB/λN

Az MS2 jelölőrendszer az MS2 bakteriofág köpenyfehérjéjén alapul, amely RNS-kötő helyet tartalmaz, amely nagy kötőaffinitással rendelkezik az RNS őshurok struktúráihoz, amelyek csak a bakteriofág RNS-ben találhatók [44]. A bakteriofágok általában ezt a burokfehérjét használják a vírus RNS genomjának beágyazottságának biztosítására [45]. Mivel ezek a hajtű -struktúrák nem léteznek az emlősök RNS -ében, az MS2 burokfehérje nem lép kölcsönhatásba a sejt által szintetizált fehérjékkel vagy RNS -ekkel. Mindazonáltal, egy olyan plazmid bevezetése, amely átírja az érdeklődésre számot tartó átiratot, amely többszörös MS2 hajtűket tartalmaz (gyakran a kiméra mRNS 3′-nem lefordított régiójába (UTR) kerül), lehetővé teszi a kabátfehérje számára, hogy nagy affinitással és specifitással kösse ezeket az exogén átiratokat (4. ábra) ). Egy fluoreszcens fehérje, például GFP fuzionálása az MS2 burokfehérjével (általában MS2-XFP) lehetővé teszi az RNS könnyű megfigyelését a sejtben [39]. A jelet felerősíthetjük úgy, hogy további hajtűket is beépítünk a 3′UTR-be, ezáltal növelve az MS2-kötő helyek számát. A legtöbb konstrukcióhoz 6-24 MS2 hajtű tartozik, amelyek hosszabb kiméra RNS -t képeznek. Hasonló rendszert fejlesztettek ki egy másik bakteriofág traktálható címke, a boxB szekvencia kiaknázására, amelyet a λN bakteriofág fehérje ismer fel. Címkézési módszereket fejlesztettek ki, amelyek nyomon követik a λN-XFP fúziós fehérjét, amely kölcsönhatásba lép egy boxer motívummal, amely egy érdekes kiméra átiratba van beillesztve [46], de ezeket ritkábban alkalmazták, mint az MS2 rendszert az elmúlt években.

4. ábra. MS2 RNS jelölés. (a) Az MS2 kísérletekhez két konstrukció előállítása szükséges. Az egyik konstrukció az érdeklődésre számot tartó RNS -t (vagy egy bizonyos régiót, például csak a 3′UTR -t) kódolja az MS2 hajtűkkel, amelyeket lefelé kódolnak. Átíráskor az MS2 hajtű a transzkriptum 3 ′ végén alakul ki, és az MS2 -kötő fehérjék (BP) felismerik. Az MS2-BP-k a másik konstrukcióból expresszálódnak, és általában tartalmaznak egy fluoreszcens fehérjét, például GFP-t. (b) A transzfekciót követően mindkét konstrukciót átírják, és az MS2-BP-ket lefordítják. A kérdéses ektópiás transzkriptumot a fluoreszcens MS2-BP-k detektálják és megkötik. A plazmidban kódolt hajtűk száma határozza meg az MS2-BP kötőhelyek számát, amelyek több hajtűt klónoznak, erősítik a jelet és javítják a detektálást. Mivel a kötetlen MS2-BP-k továbbra is fluoreszkálnak a sejtben, a megfelelő plazmid transzfekciós arány meghatározása elengedhetetlen a jel-zaj arány maximalizálásához.

Az MS2 rendszert az RNS lokalizációjának tanulmányozására használták számos biológiai környezetben. Sheth és Parker [47] bizonyította, hogy az élesztő RNS -bomlási köztes termékei citoplazmatikus feldolgozó testekben (PB) helyezkednek el. Hasonló kísérleteket használtak később annak bizonyítására, hogy a miRNS -ek és az argonaut elnyomják az mRNS transzlációt emlős PB -kben [48]. Élő Drosophila méhen kívüli expresszáló petesejtek nos-MS2 és az MS2-GFP-t használták, hogy bemutassák az mRNS transzport időzítését a fejlődő petesejtekben és a citoszkeleton szerepét az átirat-kereskedelemben [49]. MS2-címkével ellátott Pkp4 3′UTR konstrukciókat alkalmaztak annak bemutatására, hogy az adenomatózus polyposis coli-t tartalmazó ribonukleoprotein (APC-RNP) komplexekben található RNS-ek előnyben részesítették-e a FUS fehérje mutáns formáit tartalmazó granulátumokhoz [50,51] . Morisaki és munkatársai [52] nemrégiben végzett kutatásai MS2-mRNS jelölést használtak egy kísérlet részeként az egyátirat-transzláció nyomon követésére. in vivo. Az mRNS-eket MS2-vel követtük, és a születő FLAG-jelölt polipeptideket fluoreszkálóan jelzett anti-FLAG Fab fragmensekkel jelöltük. Fontos, hogy sem a címkék, sem a fluoreszcens fehérjék nem zavarták meg a normál fehérje- vagy transzkriptum-eloszlást.

Mindegyik vizsgálatban az RNS lokalizációját a szubcelluláris struktúrákhoz viszonyítva nyomon követték a fluoreszcensen jelölt fehérjékkel való kapcsolat és/vagy a fehérjemarkerek immunfestése alapján. Az MS2 rendszer könnyebben teszi lehetővé a kérdéses RNS endogén fehérjével való asszociációjának vizsgálatát, mint a FISH, mivel gyakran nincs szükség rögzítésre.

3.2. A bakteriofág címkék előnyei és hátrányai

Az MS2 címkézés a legalkalmasabb az élő sejtekben lévő RNS nyomon követésére, ami gyakorlatilag lehetetlen feladat a FISH esetében. Az MS2 rendszer fontos előnye, hogy elméletileg az MS2 RNS -címke nem befolyásolhatja az endogén RNS természetes működését. Ezzel szemben, ha egy érdekes átiratot észlelnek társított (címkézett) antiszensz oligomereken keresztül, akkor fennáll annak az esélye, hogy az oligomerek lefedhetik az RBP kötési helyét, megzavarva a normális folyamatokat, például az emberkereskedelmet vagy az RNP -komplexbe való betöltést. Ezzel szemben élő sejtekben az antiszensz oligomerek közvetlenül zavarhatják az mRNS transzlációt vagy más RNS funkciókat. Ezenkívül a rögzített sejtekben az ugyanazt a helyet RBP -ként felismerő antiszensz oligomerek elfedhetők, amikor az RBP kötődik, ezáltal megakadályozva a vizualizációt. Bár az óvatos oligomer -tervezés elkerülheti az interferencia egy részét, az oligomerek és az RBP -k közötti ismeretlen kölcsönhatások további műtermékeket hozhatnak létre. Ezzel szemben, mivel az MS2 hajtűket általában a 3′UTR disztális végéhez adják, és a kabátprotein kizárólag ezeket a hajtű -ismétléseket fogja megkötni, kevésbé aggódik a sejtfolyamatok véletlen megszakítása a kísérlet során.

Ezen előnyök ellenére ennek a technikának is vannak korlátai. Míg az extra hajtű -ismétlések klónozása fokozhatja a felismerést, a palindrom DNS -ismétlések hosszú szekvenciáinak replikációja és átírása instabil lehet, és csúszáshoz vezethet a DNS -polimerázban, ami ezeknek a hajtűknek a elvesztését vagy extra beillesztését eredményezheti [53]. Ezenkívül minden egyes kimerikus átirathoz új konstrukciót kell létrehozni, amely minden egyes konstrukcióhoz külön klónozási erőfeszítéseket igényel. A nem kötött MS2-XFP molekulák szintén magas háttérzajt okozhatnak. A jel-zaj arány javítása érdekében a sejteknek „helyes” mennyiségű MS2-jelölt RNS-t kell kapniuk az MS2-XFP plazmidokhoz képest [54]. Az MS2 rendszer legalább két plazmid transzfekcióját vagy elektroporációját igényli (az egyik az MS burokfehérjét expresszálja, a másik az MS2-vel jelölt RNS-t), és a transzfekció optimalizálása kihívást jelenthet. Végül, tekintettel arra, hogy az MS2-XFP bármilyen RNS-t kötni fog az MS2 hajtűszerkezettel, két különálló MS2-RNS egyetlen sejtben nem különböztethető meg, így a rendszer nem alkalmas a multiplexelésre. Ha több RNS kimutatására van szükség, akkor az MS2 kimutatási módszereket kombinálni kell más rendszerekkel, például molekuláris jelzőfényekkel (fent), a boxB/λN rendszerrel vagy esetleg egy CRISPR/Cas-eredetű módszerrel (lent).

4. Cas-eredetű rendszerek és élősejtes RNS-követés

A CRISPR/Cas-alapú technológiák jól ismertek óriási potenciáljukról a genomszerkesztésben és a géntechnológiában [55]. A technológiát nemrégiben kibővítették, hogy fluoreszcensen címkézett Cas fehérjéket is tartalmazzanak, amelyek megkötik és nyomon követik az RNS -t az élő sejtekben.

4.1. Cas9

A legszélesebb körben vizsgált Cas fehérje a Cas9 Streptococcus pyogenes [56,57]. A közelmúltban a Yeo labor kimutatta, hogy a katalitikusan inaktív Cas9 (dCas9) felhasználható a citoplazmában található endogén mRNS -ek nyomon követésére a stressz granulátumok, citoplazmatikus ribonukleoprotein aggregátumok összeszerelése során, amelyek átmenetileg képződnek a káros jelekre reagálva (5. ábra) [58,59] . Mivel katalitikusan inaktív, a dCas9 nem képes hasítani a cél RNS-t, ehelyett hozzá kötődik, azonban csak azokat a nukleinsavakat köti meg, amelyek protospacer szomszédos motívumot (PAM) mutatnak be. A DNS esetében a PAM-nak a nem célszálon kell lennie ([60]), mivel az emlős RNS egyszálú, Yeo és munkatársai [58] kifejlesztették a PAMmereket, rövid oligonukleotidokat, amelyek a cél-RNS-t komplementer szekvenciát tartalmazzák. a nem célzott szál felváltása. Ily módon a PAMmers társul a dCas9 - sgRNS komplexhez, és kötődik a kívánt átirathoz. A FISH-t kontrollként használva a dCas9-ről kimutatták, hogy nagy specifitással köti az mRNS-t, anélkül, hogy befolyásolná annak transzkripcióját, felezési idejét vagy transzlációját [58]. Ha nem kötődnek az sgRNS-hez, a fluoreszcens dCas9 fehérjék a magra korlátozódnak, a C-terminális kettős nukleáris lokalizációs jelek (NLS) miatt, csökkentve a citoplazmatikus jelet, amikor nem használják aktívan. A dCas9 rendszer kevesebb zajt mutatott, mint a FISH, és hatékonyan követte az endogén RNS -célokat élő sejtekben [58].

5. ábra: dCas RNS nyomkövetési módszerek. (a) A dCas kísérletekhez két plazmidra van szükség. Az egyik plazmid a katalitikusan inaktív Cas-fehérjét kódolja, olyan mutációkkal, amelyek gátolják a nukleázaktivitást. A Cas két nukleáris lokalizációs szignállal és egy fluoreszcens doménnel is módosul, például GFP vagy mCherry. A másik plazmid tartalmazza az sgRNS állványt, és átírva szintetizálja az sgRNS -t. A célzó szekvenciát az sgRNS szekvenciája határozza meg. Ha dCas9 innen S. pyogenes A PAMmer nevű külön oligomert is transzfektálni kell a sejtbe. A PAMmer nem szükséges dLwaCas13a fehérje használatakor. (b) Egy teljesen összeállított dCas9 komplex felépítése. A cél RNS -t az sgRNS célzó szekvencia azonosítja. A dCas9-hez PAM-szekvenciának kell lennie a nem célszálon. Mivel az RNS egyszálú, a PAMmer lefelé kötődik, hogy PAM szekvenciát biztosítson a dCas9 számára, hogy felismerje és kötődjön. (c) Az NLS-ek javítják a jel-zaj arányt a kötetlen dCas fehérjék elkülönítésével. Amikor a dCas szabad, vagy csak az sgRNS-hez kötődik, a fehérje a sejtmagban van a kettős NLS-tag miatt. Csak teljesen összeszerelt komplexek kerülnek a citoplazmába, amelyek dCas -ból, az sgRNS -ből, a cél -RNS -ből és a PAMmerből állnak (ha szükséges). Elvileg a citoplazmában megfigyelt bármely fluoreszcencia valódi jel.

Ennek a módszernek a korlátai közé tartozik a PAMmerek kifejlesztésének szükségessége, ami megnöveli ennek a módszernek a végrehajtását, ami megköveteli (i) egy dCas9 -et (ami meglehetősen nagy, 10–14 kbp) expresszáló plazmid transzfekcióját, (ii) az sgRNS -t, és (iii) a PAMmer oligomerek (5. ábra).a). A sejtek ilyen mennyiségű idegen nukleinsavnak való kitettsége stresszes lehet [61]. Az összetettebb kísérletek, például azok, amelyek további fúziós fehérjéket igényelnek a kolokalizáció tanulmányozásához, további kihívásokkal néznek szembe a DNS-mennyiségek és -arányok optimalizálása terén, hogy fenntartsák az elfogadható transzfekciós hatékonyságot a sejt homeosztázisának megőrzése mellett. Tekintettel arra, hogy ezt az RNS -nyomkövető rendszert nemrégiben jelentették be, nem állnak rendelkezésre források az adott RNS -t célzó sgRNS -ek vagy PAMmerek tervezéséhez, ezért a végrehajtás lassú volt. Lehetséges, hogy ezen korlátok némelyikét leküzdjük, ha az RNS-követő komponenseket közvetlenül a sejtbe juttatjuk előre kialakított dCas9-sgRNS RNP-ként. A PAMmerek, sgRNS és Cas fehérjék előzetes összeállítását a célzás egyszerűsítésére már bizonyították genomszerkesztésben, így könnyen átültethető dCas–sgRNS komplexekké is [62].

4.2. Más Cas fehérjék

Egy másik Cas rendszer, a Cas13a, elkülönítve Leptotrichia wadei (LwaCas13a) [63], a közelmúltban javaslatot tettek az élő sejtekben lévő RNS követésére. Az LwaCas13a képes megcélozni az ssRNS-t, így nincs szükség PAMmerekre, és az sgRNS az egyetlen meghatározó tényező az RNS-célzáshoz. Fluoreszcensen jelölt, katalitikusan inaktív LwaCas13a (dLwaCas13a-XFP) hatékonyan követte az endogén RNS-eket élő sejtekben. A dCas9 rendszerhez hasonlóan a dLwaCas13a rendszernek is van egy NLS-je, amely a fluoreszcens dCas13a fehérjét a sejtmagra korlátozza, hacsak nem kötődik mind az sgRNS-hez, mind a cél RNS-hez, amelyen keresztül a citoplazmába exportálódik [63]. Ez a technika felülmúlja a dCas9 rendszert, mivel a dLwaCas13a nem igényel PAMmer -t, és így a kisebb „transzfekciós terhelés” nagyobb hatékonyságot és bonyolultabb kísérleti terveket tesz lehetővé. Az adatok elemzéséhez online forrásokat fejlesztenek [63]. Azonban egyik módszer sem képes multiplex endogén követési célokat multiplexelni, mivel minden dCas9 vagy dCas13a komplex válogatás nélkül megköti az sgRNS -eket

A dLwaCas13a technika használatának számos hiányossága van. Az első az, hogy több sgRNS -t kell tesztelni a szekvenciafelismerés optimalizálása érdekében. A katalitikusan aktív LwaCas13a esetében a vezető pozíció drámai hatással volt a knockdown szintjére, és a vezető pozíció néhány bázissal történő eltolása csökkentette a gén leütését [63]. Lehetséges, hogy ez a korlátozás a katalitikusan inaktív változatnál is megfigyelhető, csökkentve annak specificitását. Ezenkívül az sgRNS -Cas komplexnek a cél transzkriptumhoz való kötődése megzavarhatja az RBP kötődését, ha az sgRNS célszekvencia átfedésben van az RBP kötőhellyel.

Egy közelmúltbeli tanulmány [64] kimutatta, hogy a Cas9 a S. aureus (SauCas9) képes megkötni és hasítani az ssRNS -t, csak az sgRNS -t igényelve, PAMmer -t nem. Míg a tanulmány csak a SauCas9 hasítási kapacitását mutatja be, egy fluoreszcens címkével ellátott inaktív változat valószínűleg képes lenne megkötni és követni az RNS-t élő sejtekben. Ebben az esetben a címkézett változat a dLwaCas13a rendszerhez hasonló módon működne. Tekintettel arra, hogy mennyire jól jellemzik a Cas9 rendszereket, ez potenciálisan a Cas-eredetű RNS-követés következő robosztus módszerévé válhat.

5. További szempontok

Számos népszerű RNS -vizualizációs módszert írtunk le, amelyek vagy fluoreszcens RNS -ekre (FISH, molekuláris beaconok, RNSscope) vagy egyedi RNS -címkéket felismerő fluoreszkáló fehérjékre (MS2/λN és katalitikusan inaktív Cas) támaszkodnak.

5.1. További erősségek és korlátozások

Amint azt fentebb tárgyaltuk, a FISH és a molekuláris jelzőfények fluorofor-jelzett antiszensz oligókat alkalmaznak, amelyek komplementer szekvenciák alapján megkötik a cél-RNS-eket [22, 26]. A FISH használata csak rögzített sejtekre korlátozódik, míg a molekuláris jelzőfények ezt a korlátozást kapcsolt leoltókon keresztül oldják meg, amelyek csökkentik a háttérzajt, amikor élő sejtekbe telepítik. Egyik módszer sem alkalmazható komplex élő szervezetekben, mivel nincsenek hatékony módszerek a szondák bejuttatására az élő szövetek nagy régióiba, például az agyba. Fix mintákban alkalmazva mindkét hibridizációs technika alkalmazható sejtekre és szövetmintákra, de az RNAscope-ot túlnyomórészt paraffinba ágyazott szövetekben található transzkriptumok kimutatására használják klinikai diagnosztika céljából [39]. Mivel mindkét technika komplementer szekvenciákat köt a célátiratokon, sikerük ezeknek a szekvenciáknak a hozzáférhetőségétől függ, ha a célpont szerkezeti motívumokban, például hajtűkben van elrejtve, vagy RBP fedi, akkor mindkét technika elveszti érzékenységét. A burkoló oligomerek használata növelheti a detektálást, mivel több fluorofor kölcsönhatásba léphet az érdeklődő átirattal. Tekintettel arra, hogy az RNAscope módszer eredendően felerősíti egyetlen szondából származó jelet anélkül, hogy mozaikszerű lenne, jobban megfelelnek ritka vagy izolált transzkriptumok kimutatására. A FISH, az RNSscope és a molekuláris jelzőfények az egyetlen olyan technika, amelyet itt tárgyalunk, amely képes több RNS -t (multiplex -észlelésként) kimutatni egyetlen vizsgálat során, ha a szondákat különböző fluoroforokkal jelölik.

A kiméra fluoreszcens RBP-k használatával végzett RNS-jelölés RNS-szekvenciák hozzáadásával történik cisz (pl. MS2, boxB) ill ford (gRNS). Bakteriofág RNS -ek (MS2, B doboz) használatakor egy, a fluoreszcensen jelzett MS2 vagy λN fehérjét expresszáló plazmidot és egy másik, az MS2 vagy boxB hajtű -ismétléssel jelölt RNS -t expresszáló plazmidot vezetnek be a sejtekbe. A fluoreszcens fehérjék ezután megkötik az RNS -címkéket, lehetővé téve az exogén transzkriptumok lokalizálását élő sejtekben. Mivel ez a vizsgálat nem függ a komplementer oligomerektől, kisebb a kockázata annak, hogy az RNS szerkezete vagy a fehérjék megkötése csökkenti az érzékenységet és kisebb aggodalmat okoz a háttérben. Egyetlen átirat érzékenysége növelhető, ha további MS2/boxB címkéket klónozunk a kiméra RNS -be, és több RBP felismerési helyet hozunk létre. A bakteriofágból származó RNS követési módszerek két plazmid (a fággal jelölt RNS és a címkekötő fehérje) transzfekcióját igénylik, és a transzfekciós arányokat optimalizálni kell az elfogadható jel: zaj arány elérése érdekében. A plazmidokat jellemzően átmeneti transzfekció útján juttatják be, anélkül, hogy stabil beépülésük lenne a genomba, így ez a módszer főleg tenyésztett sejtek és egysejtű organizmusok, például élesztő esetében hasznos. A transzfekciót és a vizsgálat végrehajtását követően a mintákat rögzíthetjük statikus képalkotáshoz is.

Hasonlóképpen, a fluoreszcens, nukleáz-hiányos Cas-fehérjéket (pl. dCas9-GFP) sgRNS-ek irányíthatják az élő sejtekben lévő RNS-ek célpontjaihoz egy további oligomer, egy PAMmer jelenlétében [58,63]. Ennek a módszernek egy változata magában foglalja a fluoreszkáló dLwaCas13a használatát, amelyhez szintén szükség van egy sgRNS -re, de nem szükséges PAMmer. A Cas fehérjékben található NLS -ek a nem használt Cas fehérjéket a magba korlátozzák, és csak a teljesen kialakult Cas -cél komplexek kerülnek a citoplazmába, csökkentve a citoplazmatikus zajt és növelve az érzékenységet. Függetlenül attól, hogy az MS2, λN vagy Cas fehérjék a kiválasztott címkézett fluoreszcens fehérjék, a plazmid transzfekciók iránti igény növeli a vizsgálat összetettségét, és megakadályozhatja további komponensek (pl. SiRNS -ek vagy további plazmidok) tesztelését ezekben a sejtekben. További korlátozások közé tartozik több cél RNS azonosítása egyidejűleg ugyanazon megközelítés alkalmazásával, a nem transzfektálható sejtek elemzése és az RNS elemzése archív mintákban. A fluoreszcens Cas-eredetű rendszerek ugyanazokkal a korlátokkal szembesülnek, mint a bakteriofág-eredetű módszerek: több plazmid transzfektálásának szükségessége, élő sejtekben vagy egysejtű szervezetekben való felhasználás korlátozása, valamint egyetlen transzkriptum nyomon követésének korlátozása. Ez azonban nem igényli a transzfekció kiterjedt optimalizálását, mivel a fluoreszcens Cas-fehérjéken lévő kettős NLS-címkék a sejtmagra korlátozzák őket, amíg a teljes komplex meg nem alakul.Ez a funkció csökkenti a citoplazma háttérjelét, és megkönnyíti annak észlelését jóhiszemű átiratjelek [63,64].

5.2. Fluoreszcens RNS aptamerek

Az RNS-aptamerek rendkívül specifikus RNS-struktúrák, amelyek számtalan célpont megkötésére képesek [65]. Aptamereket mesterséges szelekció útján hoznak létre, a SELEX néven ismert eljárást (a ligandumok szisztematikus evolúciója exponenciális dúsítással), amely lehetővé teszi azon RNS -ek azonosítását, amelyek számos ligandumot kötnek, például fehérjéket, más RNS -eket, és még olyan kis molekulákat is, mint a fluoroforok [66].

Ezeket az aptamereket mesterséges szelekcióval választják ki olyan RNS -ekhez, amelyek megkötik a festékeket, például a szintetikus GFP -t utánzó DFHBI -t (spenót) vagy tiazol -narancs (TO) -származékokat. Ha ezek a színezékek nem kötődnek aptamerekhez, gerjesztett energia szabadul fel molekuláris mozgással, például kötésforgatással [67]. A festékek azonban nem tudnak mozogni, amikor az RNS aptamerhez kötődnek, ezért ezt az energiát fénykibocsátás útján kell felszabadítani (6. ábra). Ez a folyamat eredendően csökkenti a szabad festékek által keltett háttérzajt, ami leküzdi a bakteriofágból származó RNS-címkéző rendszerek egyik legnagyobb kihívását. Miután az aptamerszekvenciát a SELEX-en keresztül azonosították, ez a szekvencia könnyen klónozható plazmidba az aptamer előállításához.

6. ábra Fluoreszcens RNS aptamerek. (a) RNS aptamer szerkezete. A kívánt festéket megkötő aptamer SELEX-ét követően ezt a szekvenciát a kérdéses átirat 3'UTR-jába klónozzuk. (b) A legtöbb festékmolekula, például a DFHBI (spenót), nem fluoreszkál, ha nem kötődik az aptamerhez. Az energia felszabadul a kötés forgása és más molekuláris mozgások révén. Amikor a festéket megköti az aptamer, a mozgás korlátozott. Ezért az energiát fényként kell kibocsátani, javítva a jel-zaj arányt és a molekuláris észlelésbe vetett bizalmat.

Ezen aptamerek alkalmazása rendkívül rugalmas. Az aptamer szekvencia egy érdekes RNS 3' régiójába klónozható, hasonlóan egy MS2 hajtűhöz, de a szekvencia sokkal rövidebb, általában 20-80 nts tartományba esik [67]. A klónozást követően ezek a jelölt RNS-ek mind fix, mind élő sejtes kísérletekben használhatók. Rögzített sejtes kísérletekhez a transzfektált sejtek több órától napig expresszálják a plazmidokat, majd rögzítik és megfestik a választott festékkel [68]. Ezek a minták továbbra is alkalmasak immunfluoreszcens festésre, így az RNS aptamer megközelítés kompatibilis az RNS-fehérje komplexek elemzésével. Az élősejtes kísérletek magukban foglalják az előállított RNS-aptamer transzkriptek transzfekcióját in vitro és festékkel előinkubálva [68]. Az aptamer-festék transzfekciót követően az átiratok nyomon követhetők in vivo minimális háttérjellel.

A fluoreszcens spenót RNS-aptamerek 2011-es bevezetése ellenére [69] az RNS-mezőben kevéssé alkalmazták a fluoreszcens RNS-aptamereket. A malachit zöld aptamerek által okozott citotoxicitás és a spenót aptamerek rossz jel-zaj aránya korlátozta a korai RNS aptamer technológiát [67]. A közelmúltban azonban egy meglévő RNS Mango aptamer fejlesztése vonzóbbá tette az aptamer megközelítést az RNS vizualizációhoz [68]. Ezek az RNS Mango aptamerek nanomoláris affinitással kötődnek a TO-biotinhoz, ahol a TO festék polietilénglikol lánccal konjugálódik egy biotin molekulához. A nagy affinitás és a nem kötődő festékek alacsony háttérzaja kombinálva hatékonyan teszi az RNS Mango rendszert az érdeklődésre számot tartó RNS -ek rögzített vagy élő sejtekben történő lokalizálására. A képalkotáson túl fluoreszkáló bioszenzorként RNS aptamereket használtak, amelyek képesek kis molekulák, például ADP vagy káliumionok detektálására [70,71]. Mivel a TO biotinilezett, ez a rendszer használható a TO -hoz kötődő RNS -ek és fehérjék tisztítására is [72]. Az RNA Mango meglehetősen olcsó, de több érdekes RNS vizsgálatához új konstrukciók klónozása szükséges ahhoz, hogy az aptamer szekvenciát a cél RNS 3′UTR-ba bejuthassák. Az RNA Mango aptamerekhez már rendelkezésre állnak erőforrások, és sokoldalúsága miatt valószínű, hogy ez a technológia hamarosan széles körben elterjedt lesz.

5.3. Fluoreszkáló in situ RNS szekvenálás

Míg az RNS FISH betekintést nyújthat az átirat mennyiségébe, az észlelést a kiválasztott célzási szekvencia korlátozza. Ennek megfelelően az antiszensz szondák nem feltétlenül észlelnek illesztési variánsokat vagy transzkriptumokat egyetlen nukleotid polimorfizmussal (SNP). Az egyházi labor legújabb munkái új módszereket vezettek be a fluoreszkáló fényhez in situ RNS -ek szekvenálása (FISSEQ) rögzített sejtekben és szövetekben [73]. A mintákat lemezekre rögzítjük, és az RNS -t cDNS -vé alakítjuk in situ fordított átírás. A cirkularizáció során a cDNS-be beépült aminokat keresztkötésre és diffúzió megelőzésére használják. A cDNS-t cirkulálják és amplifikálják gördülő kör amplifikációval, aminok térhálósítása cDNS-könyvtárakat hoz létre in situ. A cDNS-t ezután szekvenálásnak vetjük alá SOLiD szekvenálással, szekvencia-ligációs módszerrel ([74]).

Ez a technika megőrzi a citoszkeletont és a minta általános szerkezetét, és képes kimutatni a biológiailag aktív RNS-eket, így a kutatók kimutathatják a sejttípusok vagy szöveti régiók közötti funkcionális különbségeket. Használható sejtekben, formalinnal rögzített szövetekben, Drosophila embriók és indukált pluripotens őssejtekből származó organoidok [73]. A teljes eljárást konfokális, széles látóterű epifluoreszcens vagy forgó korongos mikroszkópon hajtják végre, azonban a szekvenálás több hétig is eltarthat, és előfordulhat, hogy ez a módszer nem elérhető a magmikroszkópos eszközöket használó kutatók számára. A szerzők kezdetben körülbelül 200 mRNS-leolvasást értek el sejtenként, de olyan optimalizálást javasoltak, amely ezt a hozamot körülbelül 5000 leolvasásra növelné sejtenként, elsősorban az endogén rRNS-ek kimerülése révén [73]. Kidolgozása idején a technika akár 8102 gént is képes kimutatni, amint azt a sebgyógyító vizsgálat során a fibroblasztokban láttuk [75] egyetlen itt leírt módszer sem tudja meghatározni ennek a sok átiratnak a lokalizációját. A szerzők jelezték, hogy előfordulhat, hogy a FISSEQ nem képes pontosan kimutatni az RBP -khez kötött vagy komplexekbe zárt átiratokat, valószínűleg azért, mert az ilyen komplexek rögzülnek a minta előkészítése során.

5.4. Az RNS lokalizációjának tanulmányozása az RNS funkció megértéséhez

Funkcionális sokféleségük miatt az RNS-vizsgálatok központi szerepet kaptak a sejtbiológiában. Az mRNS-ek a sejtfolyamatokhoz szükséges fehérjéket kódolják, míg a nem kódoló RNS-ek strukturális és szabályozó funkciókat látnak el, például kromatin szerveződést, riboszóma-összeállítást és transzkripciós szabályozást, poszttranszkripciós RNS-szabályozást és a fehérjeszintek és -funkciók poszttranszlációs szabályozását [76–78 ]. A transzkriptoma, különösen az RNS-seq tanulmányozására szolgáló új módszerek megjelenése számos olyan fiziológiai folyamatban és patológiában érintett RNS-t fedezett fel [9,11,12,79,80]. Bár széles körű információhoz juthatunk az RNS azonosságáról és bőségéről, hiányzik a tér-időbeli felbontás ahhoz, hogy megértsük, hogyan hatnak egymásra az RNS-molekulák a sejtgépekkel és szerkezetekkel. Ebben a tekintetben az RNS-követő technikák, például az itt leírtak alkalmazása megkezdheti a kritikus kérdések megválaszolását.

Az egyik terület, amely előnyös lehet az RNS -követésből, az extracelluláris vezikulák (EV -k, beleértve az exoszómákat és a mikrovezikulákat) mezője [81, 82]. Ezekről az apró, membránnal zárt struktúrákról korábban azt gondolták, hogy szerepet játszanak a citoplazmatikus komponensek eliminálásában [83], de a közelmúltban szerepet játszanak a rák metasztázisában, a veleszületett immunitásban és a terápiás molekulák szállításában [9,84,85]. Sok fehérjét és nukleinsavat tartalmaznak, beleértve a miRNS-eket (pl. Let-7) és az lncRNS-eket (MALAT1) [86,87], de keveset tudunk a rakományok szortírozásáról, valamint arról, hogy az elektromos járműveket hogyan szállítják be és ki a cellákból [88]. Az RNS -ek nyomon követése a szintézisről a csomagoláshoz vezető útjukon, majd a szekréción és a recipiens sejtekbe történő bejuttatáson keresztül fontos betekintést nyújthat az EV -anyagcserében részt vevő gépekbe és utakba.

5.5. RNS lokalizáció kórfolyamatokban

Számos típusú RNS-ről (mRNS-ek, miRNS-ek és lncRNS-ek) ismert, hogy kulcsszerepet játszanak a rákos megbetegedésekben [79,80], és prognosztikai markerként használták őket. Például az lncRNS-ek MALAT1 és FORRÓ LEVEGŐ metasztázis markerek a rákban, például tüdő-, emlő- és nasopharyngealis karcinómákban [89–91]. Bár potenciális célpontjai a rákos terápiás beavatkozásnak, specifikus szerepük a rosszindulatú daganatokban nem ismert, és ezért olyan kis molekulák tervezése, amelyek megzavarják vagy helyreállítják működésüket, kihívást jelent [92]. Nehéz beavatkozni a potenciális onkogén célpontokba, ha a rákot okozó funkciójuk nem teljesen ismert [93,94]. Ezért ezen RNS-molekulák térbeli-időbeli szerepének megértése kulcsfontosságú lépés az egészséges és a rákos sejtek megkülönböztetése felé. A kábítószer -szűrők olyan kis molekulákat is felfedezhetnek, amelyek az RNS -eket célozzák és megzavarják azok működését, és így előnyös lehet megfigyelni ezen átiratok működését a kezelés előtt és után, hogy megértsük a beavatkozás hatását.

5.6. Jövőbeli irányok

Az orvosbiológiai alkalmazásokon kívül sok rejtély rejlik az RNS körül, különösen a nem kódoló RNS -ek. Az ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) projekt célja, hogy azonosítsa az emberi genom összes funkcionális régióját, és jellemezze azok célját a sejtben [95]. Ez a projekt feltárta, hogy az emberi genom körülbelül 75% -a átíródik, míg a genom mindössze 1,22% -a fehérjét kódoló exonokból áll [95,96]. Amellett, hogy megkérdőjelezte az évek óta létező „szemét DNS” hipotézist, az egyes szövetekben valamikor átírt nem kódoló RNS-ek puszta mennyisége arra utalt, hogy ezen átiratok közül sok valamilyen funkciót lát el. Ezeknek a nem jellemzett átiratoknak a biológiai értékének megértése magában foglalja a szubcelluláris kompartmentek feltárását, amelyekben találhatók. Például egy nem kódoló RNS elhelyezkedése a sejtmagban szerepet játszhat a génszervezésben, a transzkripcióban és/vagy a korai feldolgozásban. A nem kódoló RNS citoplazmában történő lokalizálása szerepet játszhat az mRNS -ek vagy más citoplazmatikus molekulák stabilitásának, transzlációjának, tárolásának és/vagy mobilizációjának szabályozásában. További bizonyítékokra lesz szükség a nem kódoló RNS -ek hatásának teljes körű jellemzéséhez, de térbeli eloszlásuk megértése elfogulatlan első lépés a funkcióik tisztázásában.

A területen elért jelentős fejlődés ellenére azonban még mindig vannak korlátozások az RNS -követési módszerek alkalmazására. Az itt leírt rendszerek általában ismert RNS -szekvenciát igényelnek, vagy komplementer nukleinsavak létrehozásával, amelyek az érdeklődő átiratot keresik, vagy az RNS kiméra (traktálható) változatait kódoló vektorok kifejlesztésével. Ezért a jelenlegi nyomkövetési technológiák többsége nem alkalmas új RNS -ek felfedezésére, és az ismert RNS -ek működésének tanulmányozására korlátozódik.

Egyre jobban felismerik, hogy a kódoló és nem kódoló RNS-ek kulcsfontosságú szerepet töltenek be minden sejtfolyamatban, beleértve a kromatin szerveződését, a transzkripció szabályozását, a transzkripció utáni események szabályozását (mRNS transzport, stabilitás, tárolás és transzláció) és a poszttranszlációs folyamatokat, például a fehérje stabilitását. és multiprotein összeállítás. Ezekkel a bővülő funkciókkal együtt arra is gyűlnek a bizonyítékok, hogy az RNS szabályozási zavara olyan főbb betegségekhez vezethet, mint a rák, a neurodegeneráció, a szív- és érrendszeri betegségek és a metabolikus szindróma. Ahogy javul az RNS -ek követésére való képességünk, betekintést nyerünk hatásmechanizmusukba, bővítve az RNS -ek funkcionális megértését és lehetővé téve a terápiás helyszínek fejlesztését.


Helikáz és polimeráz

A DNS replikációja enzimként kezdődik, DNS helikáz, megszakítja a két szálat összetartó hidrogénkötéseket, és a replikációs villa (lásd a ( PageIndex <6> . ábrát). A kapott szerkezet két elágazó DNS -gerincoszlopot tartalmaz, amelyeknek szabad bázisa van. Ezek az expozíciós bázisok lehetővé teszik, hogy a DNS -t egy másik enzim tudja & ldquoread & rdquo DNS polimeráz, amely ezután felépíti a komplementer DNS -szálat. Ahogy a DNS -helikáz továbbra is megnyitja a kettős hélixet, a replikációs villa növekszik.

Vezető és lemaradt szálak

Két DNS -polimeráz enzim dolgozik egy replikációs villán. Ez az enzim csak az 5' &rarr 3' irányba tud új DNS-t építeni. Ehhez is kell a alapozó által építve primáz hogy elkezdje építeni a DNS -t. Ezért a két új szál, az leading szál és a lemaradó szál, a DNS ellentétes irányban épülnek fel. A vezető szál az a DNS -szál, amelyet a DNS -polimeráz 5 '& rarr 3' irányban konstruál. Ez a DNS -szál folyamatosan készül, a replikációs villa növekedésével mozog. A "lagging&rdquo szál rövid szegmensekben, úgynevezett Okazaki töredékek. Az elmaradt szálon, primáz rövid RNS primert épít fel. A DNS-polimeráz ezután képes az RNS-primeren lévő szabad 3'-OH-csoport felhasználásával DNS-t készíteni az 5 '& rarr 3' irányban, amíg eléri a templát szál végét. A lemaradó szál DNS -polimeráza ezután felugrik, és továbbmegy a replikációs villába, hogy újabb Okazaki -fragmentumot hozzon létre. Az RNS-fragmenseket ezután lebontják, és új DNS-nukleotidokat adnak hozzá, hogy kitöltsék azokat a réseket, ahol az RNS jelen volt. Egy másik enzim, DNS ligáz, ezután képes összekapcsolni (ligálni) a DNS nukleotidokat, befejezve a lemaradó szál szintézisét ( ( PageIndex <6> ) ábra).

( PageIndex <6> ) ábra: DNS replikáció. A két DNS-szálat helikáz nyitja meg. A szálakat egyetlen szál kötőfehérje tartja nyitva, megakadályozva a korai újrafelzáródást. A topoizomeráz megoldja a DNS feltekerése/feltekerése által okozott feszültség okozta problémát. Ez az enzim körülveszi a DNS -t, és elvágja, lehetővé téve a spirál forgatását és ellazulását. Amint a DNS ellazul, a topoizomeráz újra összekapcsolja a törött szálakat. A DNS-primáz egy rövid RNS-primert szintetizál, amely elindítja az Okazaki-fragmenst és a vezető szálat. A DNS polimeráz szintetizálja a vezető szálat és az Okazaki fragmentumokat. Az Okazaki-fragmenseket DNS-ligáz köti a primerek eltávolítása után.


Homodimer interfész bázispárok nélkül a vörös fluoreszcens fehérjét utánzó RNS -ben

A kukorica, egy 28 nukleotid RNS, rokon ligandja, a 3,5-difluor-4-hidroxi-benzilidén-imidazolinon-2-oxim (DFHO) sárga fluoreszcenciáját több mint 400-szorosára növeli. A kukoricát kiválasztották in vitro más fluorogén RNS-ek korlátainak leküzdésére, különösen a gyors fényfehérítésre. Most beszámolunk a kukorica-DFHO-kristályszerkezetről, felfedezve, hogy a funkcionális faj egy kvázi-szimmetrikus homodimer. Szokatlan módon a dimer határfelület, amelyben hat párosítatlan adenozin megtöri a teljes kétszeres szimmetriát, nem tartalmaz intermolekuláris bázispárokat. A homodimer egy DFHO-t kapszuláz az interprotomer interfészen, és minden protomerből G-quadruplex szendvicset tartalmaz. A kukorica és a zöld fluoreszkáló spenót RNS szerkezetileg nem függ össze. A G-kvadrupplexek konvergens felhasználása aláhúzza ennek a motívumnak az RNS-indukált kismolekulájú fluoreszcenciában való hasznosságát. A kukorica aszimmetrikus dimer interfésze alapot adhat a csak heterodimerként fluoreszkáló mutánsok kifejlesztéséhez. Az ilyen változatok analógok lennének a Split GFP-vel, és hasznosak lehetnek az RNS koexpressziójának vagy asszociációjának elemzésére, vagy önszerveződő RNS nanostruktúrák tervezésére.


Hogyan vannak helyesen hozzárendelve az aminosavak a tRNS-molekulákhoz?

A megfelelő aminosav hozzárendelése a tRNS minden formájához döntő fontosságú a transzlációs folyamat szempontjából. Ezt a hozzárendelést húsz különböző enzim végzi, amelyeket aminoacil-tRNS-szintetázoknak (aaRS) neveznek a fehérjékbe beépített húsz aminosavhoz. Úgy gondolják, hogy 31 különböző tRNS létezik, de ez a 20 szintetáz képes mindegyiket "feltölteni" a megfelelő aminosavval.


CH 105 - Kémia és társadalom

A DNS a genetikai információ hordozója a szervezetekben. Az mit jelent? A szervezetben lévő nagy molekuláknak számos funkciójuk lehet: struktúrát nyújthatnak, katalizátorként működhetnek a kémiai reakciókban, a környezetükben bekövetkező változások érzékelésére szolgálnak (immunválaszhoz vezetve az idegen betolakodókkal szemben és idegi reakciókhoz ingerekre, például fényre, hőre, hangra, érintés stb.) és mozgékonyságot biztosít. A DNS valóban nem tesz semmit ezek közül. Inkább úgy tekintheti, mint egy információ tároló rendszert. Az információt dekódolni kell, hogy lehetővé váljon más nagy molekulák felépítése. A többi molekula általában fehérjék, a test nagy polimerjeinek egy másik osztálya. A kromoszómák a sejtmagban helyezkednek el.

A kromoszómák a sejtmagban találhatók. A DNS -t meg kell másolni egy ún replikáció mielőtt egy sejt osztódna. A DNS replikációja lehetővé teszi, hogy minden leánysejt a kromoszómák teljes komplementjét tartalmazza.

A tényleges információkat a kromoszómák DNS -jében dekódolják egy ún átirat egy másik nukleinsav, ribonukleinsav vagy RNS képződésével. Az RNS polimeráz enzim által termelt RNS komplementer a DNS egyik szálával. Az RNS abban különbözik a DNS-től, hogy az RNS ribózt tartalmaz, nem dezoxiribózt, hanem cukrot a gerincében. Ezenkívül az RNS -ből hiányzik a T bázis. Ehelyett az U bázissal helyettesítik, amely komplementer A -val (mivel T komplementer A -val a DNS -ben). A képződött RNS hírvivőként működik, amely a sejtmagból a sejt citoplazmájába jut. Valójában az ilyen típusú RNS -t gyakran hírvivő RNS -nek, mRNS -nek nevezik. Mivel a nukleinsavban (DNS) található információk egy másik nukleinsav (RNS) formájában átalakulnak információvá, ezt a folyamatot transzkripciónak nevezik (mivel a nyelv még mindig ugyanaz, például amikor egy angol nyelvű írásbeli beszédet átír írott angol).

A DNS -ből származó információkat, amelyek most lineáris RNS -szekvencia formájában vannak, dekódoljuk egy ún fordítás, fehérjét, egy másik biológiai polimert képezni. A fehérje monomerjét aminosavnak nevezik, teljesen más típusú molekula, mint a nukleotid. Húsz különböző természetben előforduló aminosav létezik, amelyek a központi szénhez kapcsolódó 4 csoport egyikében különböznek. Egy aminosavban a központi (alfa) szén egy amincsoportot (RNH) tartalmaz2), egy karbonsavcsoport (RCO2H), és H, és egy R csoport kapcsolódik hozzá. Mivel a nukleinsavban (RNS) található információ egy másik molekula, egy fehérje formájában alakul át információvá, ezt a folyamatot ún. fordítás (mivel a nukleinsavak nyelve a fehérjékre változik, például amikor lefordítja az angolt kínaira).

A DNS és az RNS komplementaritásával ellentétben (1 bázis az RNS -ben 1 bázissal komplementer RNS -ben) az RNS -ben levő bázis (az RNS monomer egység része) és a fehérje monomerje között nincs 1: 1 arányú megfelelés . Sok munka után kiderült, hogy az RNS-ben egy 3 nukleotidból álló, összefüggő lineáris szekvenciát dekódol a citoplazma molekuláris gépezete, aminek eredményeként 1 aminosavat adnak a növekvő fehérjéhez. Ezért a DNS -ben és az RNS -ben lévő hármas nukleotidok információt tartalmaznak egy fehérje 1 aminosaváról.Az, hogy a nukleinsavak nukleotidjai és a fehérjékben található aminosavak között nincs 1:1 egyezés, már régen nyilvánvaló volt, mivel csak 4 különböző DNS-monomer (A-val, T-vel, G-vel és C-vel) és 4 különböző RNS-monomer (A-val) létezik. , U, G és C), de 20 különböző aminosav monomer létezik, amelyek fehérjéket alkotnak.

Most kiderült, hogy egy organizmus DNS-szekvenciájában nem minden információ kódol egy fehérjét. Valójában a 3 milliárd bázispárnak csak körülbelül 2% -a látszik átíródni RNS -be, amely fehérjévé transzlálható. A többi DNS funkciója jelenleg bizonytalan. Honnan tudja a sejt molekuláris gépezete, hogy a DNS melyik része kódolja a fehérjéket. Kiderült, hogy egyedi DNS-szekvenciák találhatók a DNS-szekvencia azon részének elején és végén, amely egy fehérjét kódol. Folytassa a kromoszóma DNS -ét, és hirtelen olyan jelekhez jut, amelyeket a sejtgép felismer. Komplementer RNS -t készítenek ebből a szakaszból, majd a komplementer RNS -t egyetlen fehérjévé dekódolják. Folytassa tovább a DNS -szekvenciát, és egy másik ilyen kódolószekvenciát talál, amelyet át lehet írni egy mRNS -be, majd ezt követően egy másik egyedi fehérjévé alakítható. Összesen körülbelül 30 000 ilyen DNS -szakasz található az összes kromoszómában, amelyek 30 000 egyedi fehérje információit kódolják. A DNS-nek ezeket az egyedi kódoló szakaszait, amelyek végül egyedi mRNS-sé íródnak át, amelyek egyedi fehérjékké alakulnak, az ún. gének. Céljaink szerint arra a következtetésre jutunk, hogy egy gén rendelkezik egy fehérje információival. Mindegyik fehérje eltér egymástól mind a hosszukban, mind a fehérjében lévő aminosavak szekvenciájában. A DNS valóban a sejt tervrajza. A sejtek tényleges tulajdonságait a sejt által termelt tényleges fehérjék határozzák meg.

Nemcsak a DNS -t kell átírni a DNS -be, hanem a DNS -ben lévő genetikai információkat is meg kell replikálni, mielőtt egy adott sejt osztódik, hogy a leánysejtek mind ugyanazt a genetikai információt tartalmazzák. A replikáció során a dsDNS elválik, és egy enzim, a DNS-polimeráz, komplementer másolatokat készít minden szálról. A két keletkező dsDNS -szál osztódás közben elválik a különböző leánysejtektől. Azt a folyamatot, amikor a DNS replikálja a sejtek osztódását, és átírják RNS -be, amely fehérjévé alakul át, a biológia központi dogmájának nevezik. (figyelmen kívül hagyja a tRNS -t, rRNS -t és snRNS -t az előző webes linkben)

Amint fentebb említettük, minden aminosavat az RNS három nukleotidjának egy adott kombinációja határoz meg. A három bázist kodonnak nevezzük. A genetikai kód egy diagramból áll, amely megmutatja, hogy a 20 aminosav közül melyik hármas RNS -szekvencia vagy kodon mRNS -kódokat tartalmaz. Az egyik kodon kódolja az aminosavakat, és arra szolgál, hogy megállítsa a fehérje szintézisét az mRNS -szekvenciából. A genetikai kód az alábbiakban látható:

A fehérjeszekvencia meghatározása DNS-szekvenciából.

Egy adott gén esetében csak a DNS egyik szála szolgál templátként a transzkripcióhoz. Az alábbiakban egy példa látható. Az alsó (kék) szál ebben a példában a sablon szál, amelyet más néven a mínusz (-) szál, vagy a érzék part. Ez a szál szolgál sablonként az mRNS szintéziséhez. Az RNS-polimeráz enzim egy mRNS-t szintetizál az 5'-3' irányban, amely komplementer ezzel a templátszállal. Az ellentétes DNS-szálat (piros) nevezzük c oding szál, a nem tervez szál, a plusz (+) szál, vagy a antiszensz part.

A legegyszerűbb módja a megfelelő megtalálásának mRNS szekvencia (alább zölden látható) olvassa el a c oding, nem sablon , plusz (+) , vagy antiszensz A szál közvetlenül az 5 ' - 3' irányban helyettesíti az U -t T. Keresse meg a triplettet a kódoló szálban, változtasson meg minden T -t U -ra, és olvassa le a genetikai kódból a megfelelő aminosavat, amely beépülne a növekvő fehérjébe. (Az alábbi szálakat hármasokra osztjuk a könnyebb láthatóság érdekében.) Az alábbiakban látható egy példa.

VÉGE ALAPSZEMLE A BIOLÓGIA KÖZPONTI DOGMÁJÁT

A DNS és RNS lineáris polimereivel ellentétben a fehérjék (aminosavak lineáris polimerjei) a 3D térben hajtogatva egyedi formájú struktúrákat alkotnak. Mindegyik egyedi fehérjeszekvencia (meghatározott hosszúságú és aminosavszekvenciájú) egyedi 3D alakúra hajlik. Ezért körülbelül 30 000 különböző formájú fehérje található az emberekben. A fehérjéknek nemcsak egyedi formájuk van, hanem egyedi zuguk és zsebük is, amelyek lehetővé teszik számukra, hogy más molekulákat megkötjenek. Más molekulák fehérjékhez vagy DNS -hez való kötődése elindítja vagy megszünteti a fehérje vagy a nukleinsav funkcióját, hasonlóan a ki/be kapcsolóhoz. Az alábbi példa különböző fehérjeszerkezeteket mutat be, amelyek közül néhányhoz kis molekulák vagy nagy molekulák (például DNS) kapcsolódnak. Néhány gyakori motívum megtalálható a fehérje 3D szerkezetében. Ide tartoznak az alfa hélixek és a béta lapok. Ezeket H-kötések tartják össze a fehérje gerincében lévő N-en lévő enyhén pozitív H és a fehérje gerincében távolabb lévő enyhén negatív O között. Az alábbi Chime modellekben az egérgombokkal forgassa el a molekulát. (Az L egér lenyomásával is megváltoztathatja a molekula méretét). Kattintson a parancsra a jobb oldali keretben a fehérjék megjelenítésének megváltoztatásához. A karikatúra nézet lehetővé teszi a fő lánc általános szerkezetének egyszerű értelmezését.

Ha egy kódoló régióban a DNS-szekvencia megváltozik, akkor a keletkező mRNS is megváltozik, ami a fehérjeszekvencia megváltozásához vezet. Ezeknek a változásoknak lehet, hogy nincs hatásuk és némák, ha a fehérje változása nem befolyásolja a fehérje hajtogatását vagy más fontos molekulához való kötődését. Ha azonban a változások akár a hajtogatási, akár a kötőrégiót érintik, előfordulhat, hogy a fehérje nem tudja ellátni szokásos funkcióját. Azok a mutációk, amelyek a poláros aminosavakat poláris/töltött aminosavakkal (vagy fordítva) helyettesítik, a legnagyobb eséllyel jelentős változásokat idéznek elő szerkezetükben és/vagy aktivitásukban.

Ha a funkció a sejtosztódás szüneteltetése lenne, az eredmény rákos megbetegedést eredményezhet. Hasonlóképpen, ha a normál fehérjének szerepe volt abban, hogy a sejt elpusztuljon a tervezett élettartam után, a mutáns fehérjét tartalmazó sejt esetleg nem pusztul el, és nagyobb valószínűséggel daganat lesz. Az ellenkező forgatókönyvek megtörténhetnek, ami a sejt korai halálához vezet.

  • Pontmutációk: balszerencse és nukleotid analógok
  • Pontmutációk: kémiai mutagénekből
  • Nagy mutációk: törlések, beszúrások, duplikációk és inverziók

Tekintse meg a sarlósejtes hemoglobin alábbi modelljét, amely bemutatja, hogy egyetlen bázispár változás a DNS-ben hogyan változtathat meg egy aminosavat egy fehérjében, ami halálos következményekkel járhat.

Gének és betegségek

A gén transzkripció aktiválása és visszaszorítása:

  1. Hogyan lehet elnyomni a génexpressziót higany hiányában
  2. Hogyan aktiválódhat a génexpresszió higany jelenlétében

A modern biológia egyik központi kérdése az, hogy mi szabályozza a génexpressziót. Amint azt korábban leírtuk, a géneket & quot kell bekapcsolni & quot a megfelelő időben, a megfelelő sejtben. Első megközelítésben a szervezet összes sejtje ugyanazt a DNS -t tartalmazza (kivéve a csírasejteket és az immunsejteket). A sejttípust az határozza meg, hogy egy adott időpontban milyen gének expresszálódnak. Hasonlóképpen a cella változhat ( különbséget tenni ) különböző sejttípusokba, a gének expressziójának megváltoztatásával. A biológia központi dogmája leírja, hogy a géneket először hogyan írják át az RNS -be, majd az mRNS -t egy megfelelő fehérjeszekvenciává. A fehérjék ezután poszt-transzlációs úton módosíthatók, lokalizálhatók a sejtek bizonyos területein, és végül lebonthatók. Ha a funkcionális fehérjéket a génexpresszió végtermékének tekintjük, akkor a génexpresszió szabályozása elméletileg a folyamat ezen lépéseinek bármelyikén megtörténhet.

A génexpressziót többnyire azonban a transzkripció szintjén szabályozzák. Ennek nagy biológiai értelme van, mivel kevésbé lenne energetikailag pazarló egy funkcionális fehérje végső expresszióját a folyamat korai szakaszában indukálni vagy gátolni. Hogyan szabályozható a génexpresszió transzkripciós szinten? Számos példát dokumentáltak. A fő szabályozást jellemzően az RNS polimeráz szintjén fejtik ki kötés csak felfelé (5') a transzkripciós iniciációs helytől. Más faktorok, úgynevezett transzkripciós faktorok (amelyek általában fehérjék), ugyanahhoz a régióhoz kötődnek, és elősegítik a RNS polimeráz kötési helyén, az úgynevezett promóter. A fehérjék a DNS helyeihez is kötődhetnek (operátor a prokariótákban), és gátolhatják a transzkripciós komplex összeállítását, és ezáltal a transzkripciót. A géntranszkripció szabályozása ekkor kérdéssé válik kötés a megfelelő transzkripciós faktorok és RNS-polimerázt a megfelelő régióba a géntranszkripció kiindulási helyén. A génexpresszió fehérjék általi szabályozása lehet pozitív vagy negatív. A prokariótákban a szabályozás általában negatív, míg az eukariótákban pozitív.

A legtöbb eukarióta génnek körülbelül 5 szabályozó helye van a transzkripciós faktorok és az RNS -polimeráz megkötéséhez. Ezekre a transzkripciós faktorokra példák láthatók az alábbi ábrán.

A MEGHATÁROZOTT DNS -KÖTŐ OLDALOK SZERKEZETI JELLEMZŐI

Mivel az RNS polimeráznak kölcsönhatásba kell lépnie az összes gén promoter helyén, várható, hogy minden gén hasonló nukleotidszekvenciával rendelkezik a promoter régióban. Ez igaz mind a prokarióta (például baktériumok), mind az eukarióta génekre. Azt várná azonban, hogy minden transzkripciós faktor nem azonos DNS -kötő szekvenciával rendelkezik. A DNS -szekvenciákat közvetlenül a fehérjét kötő gén kezdőhelyétől felfelé (RNS -polimeráz, transzkripciós faktorok stb.) Nevezzük. promóterek. Az alábbi táblázat az általános DNS szekvencia motívumot mutatja be Pribnow vagy TATA doboz körülbelül -10 bázispárnál található a kezdőhelytől felfelé, és egy másik -35 bázispárnál. A fehérjék ezekhez a helyekhez kötődnek, és megkönnyítik az RNS -polimeráz kötődését, ami gén transzkriptont eredményez.

Prokarióta Promoter szekvenciák

Ezen túlmenően, az eukarióták promotereiben, a szekvenciák további felfelé nevezett válasz elemek specifikus fehérjéket (például CREB vagy ciklikus AMP válaszelem kötő fehérje) kötnek a gén transzkripció további szabályozásához.

Eukarióta reakcióelemek (RE)

A fehérjék specifikusan kölcsönhatásba léphetnek a DNS-sel elektrosztatikus, H-kötés és hidrofób kölcsönhatások révén. Az AT és GC bázispárok rendelkezésre állnak H kötés donorokkal és akceptorokkal, amelyek a ds DNS hélix nagyobb és kisebb ligetében vannak kitéve, lehetővé téve a specifikus fehérje-DNS kölcsönhatásokat.

Jmol: Egyszerű DNS bemutató (lásd az utolsó kiválasztó gombokat a H -kötés donorok és elfogadók megtekintéséhez a nagy ligetben.

A DNS-KÖTŐ FEHÉRJÉK SZERKEZETI JELLEMZŐI

  • spirál-fordulat-spirál : prokarióta DNS -kötő fehérjékben található. Az ábrák két ilyen fehérjét mutatnak be, a cro represszor 434 bakteriofágot és a lambda represszort a lambda bakteriofágból. (A bakteriofágok baktériumokat fertőző vírusok.) Figyeld meg, hogyan érhető el a specificitás részben azáltal, hogy specifikus H-kötéseket hoznak létre a fehérje és a kezelő DNS fő ligete között.
  • Lambda represszor/DNS komplex
  • H Kötési kölcsönhatások l represszor és DNS között
  • cink ujj : (eukarióták) Ezeknek a fehérjéknek közös szekvencia motívuma van
    x3- Cys -X2-4- Cys -X12- Övé -X3-4- Övé -X4- amelyben X bármely aminosav. A Zn 2+ tetraéderesen koordinálódik a Cys és His oldalláncokkal, amelyek a két antiparallel béta szál egyikén, illetve egy alfa hélixen találhatók. A cink ujja, amelyet a cink stabilizál, kötődik a DNS fő barázdájához.
  • szteroid hormon receptorok : (eukarióták) A legtöbb hormonnal ellentétben, amelyek a sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek, a szteroid hormonok (koleszterin származékai) áthaladnak a sejtmembránon, és egy hormonkötő doménen keresztül kötődnek a citoplazmatikus receptorokhoz. Ez megváltoztatja a receptor alakját, amely azután egy DNS-kötő doménen keresztül a DNS egy meghatározott helyéhez (hormonválaszelem) kötődik. A cinkujjhoz hasonló struktúrában a Zn 2+ tetraéderesen 4 Cys-re van koordinálva, egy gömbszerű szerkezetben, amely dimerként kötődik két nagy, de fordított DNS-szekvenciához (palindrom). (Példa egy palindromra: Képes voltam, ha láttam Elbát.)
  • leucin cipzárak : (eukarióták) Ezek a fehérjék 35 aminosavból álló szakaszokat tartalmaznak, amelyekben a Leu ismétlődően megtalálható 7 aminosav időközönként. A fehérje ezen régiói amfifil hélixeket képeznek, egyik oldalán Leu. E fehérjék közül kettő dimert képezhet, amelyet ezen amfifil spirálok egymáshoz való kötődése stabilizál, és feltekercselt tekercset képez, mint a miozin izomfehérje. Ennélfogva a leucin cipzár a fehérje fehérjekötő doménjét képviseli. A DNS-kötő domén az első 30 N-terminális aminosavban található, amelyek bázikusak és alfa-hélixet képeznek, amikor a fehérje kötődik a DNS-hez. A leucin cipzár ezután úgy működik, hogy összekapcsolja a két DNS-kötő fehérjét, lehetővé téve, hogy az N-terminális bázisok hélixei bázis-specifikus módon kölcsönhatásba lépjenek a DNS fő barázdájával.

FOSZFORILÁCIÓ ÉS A GÉNKIFEJEZÉS SZABÁLYOZÁSA

A génexpresszió szabályozásának általános módja a transzkripciós faktorok ATP általi foszforilációjának szabályozása. Ez a módosítás aktiválhatja vagy gátolhatja a transzkripciós faktort a génexpresszió beindításában. A hozzáadott foszfátcsoportokra szükség lehet a közvetlen kötődési kölcsönhatásokhoz, amelyek gén transzkripcióhoz vezetnek, vagy a transzkripciós faktor konformációs változásához vezethetnek, ami aktiválhatja vagy gátolhatja a géntranszkripciót. Ennek a későbbi esetnek a friss példája a p53 transzkripciós faktor aktivitásának szabályozása. A p53-nak számos aktivitása van a sejtben, elsődlegesen a tumorsejtek növekedésének szuppresszoraként. Ha egy sejtet olyan stressznek tesznek ki, amely genetikai károsodást okoz (ez nyilvánvaló, ami a sejtet tumorsejtté alakíthatja), akkor ez a fehérje aktív transzkripciós faktorrá válik, ami számos gén expressziójához vezet, beleértve azokat is, amelyek részt vesznek a programozott sejtben a halál és a sejtciklus szabályozása. Mindkét hatás egyértelműen gátolhatja a sejtproliferációt. Ezért a p53 egy tumorszuppresszor gén. A p53 általában a HDM2 fehérjéhez kötődik, amely lefelé szabályozza annak aktivitását azáltal, hogy lebomlik. A stressz jelek a protein kinázok aktiválásához vezetnek a sejtben (például p38, JNK és cdc2), ami a p53-ban található szerin és trenin aminosavak foszforilációját okozza (Ser 33 és 315 és Thr 81). Ez a Pin 1 fehérje kötődéséhez vezet, ami megváltoztatja a p53 alakját, és transzkripciós faktorként aktiválódik.


Nézd meg a videót: DNA replication - 3D (Január 2022).