Információ

CD4+ mint monociták sejtfelszíni receptorok


Ma az osztályban tanárunk a HIV -vírus kórokozójáról tárgyalt.

Azt mondta, hogy a HIV vírus és a makrofágok közötti kötődést a vírus GP120 és a CD4 receptorokkemokin receptorok (CCR-5 és CXCR-4) és fuzin receptorok jelen vannak Makrofágok.

Kétlem, hogy szerintem a CD4 receptorok csak a T-helper sejteken vannak jelen. A makrofágokon is jelen vannak? Rossz elképzelésem van a CD4 receptorokról? Ha nem, akkor vannak más receptorok, amelyek felelősek a vírusrészecskék monocitákon és dendrites sejteken belüli átviteléért?

Bármilyen további információt szívesen fogadunk.


A makrofágok és a monocita sejtek képesek CD4, CD8 expresszióra vagy akár együttes expresszióra. A CD4 és CD8 molekulák kölcsönhatásba lépnek a szomszédos sejteken lévő MHC komplexekkel, és ahogy azt el lehet képzelni, változó hatást váltanak ki sejttípustól függően.

Nyilvánvalóan Zhen és mtsai. kimutatta, hogy a monocitás CD4 ligálás más sejteken, például az aktivált endotéliumon lévő MHC-II molekulákhoz, expressziós mintázatot indukált a makrofágok differenciálódásához (1). Gibbings és mtsai. azt is kimutatták, hogy a CD8 a monocita felszínén lévő FcyR-hez hasonlóan a CD8/TCR asszociációkhoz kapcsolódik, és serkenti a citokinek szekrécióját (2).

Megpróbálok modellforrást találni, de a CD8a a dendritikus sejteken társulhat a T-sejteken lévő MHC-II molekulákhoz, például a HLA-DR-hez, és elősegítheti a T-sejtek kereszt-alapozását.

Most már kevésbé világos számomra, hogy a CD4 mit tesz a funkcionális, differenciált makrofágokkal, és kicsit jobban át kell néznem az ezzel kapcsolatos szakirodalmat. Ez lehet csak expressziós lenyomat, mert monocita eredetű sejtek, vagy olyan hatást válthat ki, mint a fenti CD8/FcryR. Nem tudom.

Több eset is van, ezért ezek válogatott példaként szolgálnak.


Biológia: CD4

A molekuláris biológiában CD4 (4. differenciálódási klaszter) egy glikoprotein, amely az immunsejtek, például T -segítő sejtek, monociták, makrofágok és dendritikus sejtek felszínén található. Az 1970-es évek végén fedezték fel, és eredetileg leu-3 és T4 néven ismerték (a vele reagáló OKT4 monoklonális antitest után), mielőtt 1984-ben CD4-nek nevezték el. Ώ ] CD4 gén. ΐ ] Α ]

A CD4+ T segítő sejtek olyan fehérvérsejtek, amelyek az emberi immunrendszer lényeges részét képezik. Gyakran CD4-sejteknek, T-helper-sejteknek vagy T4-sejteknek nevezik őket. Segítősejteknek nevezik őket, mert egyik fő szerepük az, hogy jeleket küldjenek más típusú immunsejteknek, beleértve a CD8 gyilkos sejteket, amelyek ezután elpusztítják a fertőző részecskét. Ha a CD4 -sejtek kimerülnek, például kezeletlen HIV -fertőzés esetén, vagy a transzplantáció előtti immunszuppresszió után, a szervezet sebezhetővé válik olyan fertőzések széles skálájával szemben, amelyekkel egyébként képes lett volna harcolni.


A klatrinnal bevont gödrökkel való receptor társulás másodlagos hírvivő szabályozása: új és szelektív mechanizmus a CD4 endocitózis szabályozásában.

A CD4, az immunglobulin szupercsalád tagja, nemcsak a T4 helper limfocitákban, hanem a mieloid sejtekben is expresszálódik. A receptor által közvetített endocitózis döntő szerepet játszik az adhéziós molekulák, például a CD4 felszíni expressziójának szabályozásában. A T-limfocitákban a p56lck, egy CD4-hez kapcsolódó tirozin-kináz megakadályozza a CD4 internalizációját, de a mieloid sejtekben a p56lck nem expresszálódik, és a CD4 konstitutívan internalizálódik. Ebben a tanulmányban a ciklikus AMP (cAMP) szerepét vizsgáltuk a CD4 endocitózis szabályozásában a HL-60 mieloid sejtvonalban. A celluláris cAMP emelkedését 1) kolera -toxin, 2) pertussis toxin, 3) forskolin és IBMX, 4) NaF vagy 5) a prosztaglandin E1 fiziológiai receptor agonista váltotta ki. Mind az öt beavatkozás a CD4 internalizáció gátlásához vezetett. A megemelkedett cAMP szint önmagában nem gátolta az endocitózist, mivel az inzulinreceptorok és transzferrin receptorok internalizációja és a folyadékfázisú endocitózis nem változott, vagy enyhén fokozódott. A cAMP-gátlás mechanizmusát tovább elemeztük ultrastrukturális szinten. A CD4 internalizálása, amelyet kvantitatív elektronmikroszkópos autoradiográfia vagy immunarany jelölés követett, a CD4 gyors és hőmérsékletfüggő asszociációját mutatta ki a kontrollsejtek klatrinnal bevont üregeivel. Ez az asszociáció jelentősen gátolt volt az emelkedett cAMP-szintű sejtekben. Így ezek az eredmények a CD4 internalizációjának másodlagos hírvivő szabályozására utalnak a p56lck-negatív sejtekben a CD4 klatrinnal bevont gödrökkel való asszociációjának gátlásán keresztül.


A HIV-1 fertőzés klinikai jellemzői

A HIV-1 vírust a testnedvek cseréje továbbítja. Az átvitel módja magában foglalhatja a szabad virionok vagy HIV-1-fertőzött sejtek átvitelét. A kezdeti (akut) HIV-1 fertőzés 1-3 héten belül klinikai tüneteket eredményez az újonnan fertőzöttek legalább felében. Ezek a tünetek hasonlóak az influenzához vagy a mononukleózishoz, valamint a nem viszkető makula eritematózus kiütésekhez. 52 Röviddel az akut fertőzés után a legtöbb beteg szerokonverzión megy keresztül. Ezt követi a klinikai várakozási idő, amely 3 -tól több mint 15 évig tarthat, mielőtt az AIDS kialakulna, és a beteg végül meghalna több fertőzésben és/vagy rosszindulatú daganatban. Az AIDS előrehaladását a CD4 + T -limfociták elvesztése kíséri, a tünetek 500 sejt/l alatti vérszintnél észlelhetők. Bár a HIV-1-vel fertőzöttek túlnyomó többsége AIDS-ben fog szenvedni, egyre több bizonyíték van arra, hogy egyesek képesek hosszú ideig együtt élni a vírussal anélkül, hogy klinikai betegség alakulna ki. Az ilyen egyéneket „hosszú távú nem haladóknak” nevezik, bár csak az idő fogja eldönteni, hogy ez a csoport is belehal-e a betegségbe. 53 Az AIDS-be való progresszió mértékét befolyásoló tényezők (áttekintésért lásd a Levy 54-et): az életkor (a legtöbb HIV-1-fertőzött csecsemő viszonylag lassan halad előre 55, 56), az általános egészségi állapot (más fertőzések jelenléte felgyorsíthatja az AIDS-be való előrehaladást 57) és életmód (dohányzás, 58 alkohol 59 és drogfogyasztás 60 mind felgyorsíthatják a progressziót). A fertőző HIV-1 törzsben és a gazdaszervezet immunválaszában mutatkozó különbségek valószínűleg szintén fontosak a betegség progressziójának arányában.


A CD8 -at és a CD4 -et különböző típusú expresszáló sejttípusok az emlősfajok között

A CD8 -at és a CD4 -et számos olyan sejttípus fejezi ki, amelyek nem expresszálják a TCR -t, bár erre az állításra figyelmeztetni kell, ha neutrofileken [21] átrendeződött TCR -t mutatnak be, és átrendezett TCR -gének jelen vannak DC -kben [4] és NK -sejtekben [22]. . Az egér- és emberfajok immunrendszerében jelentős különbségek vannak [23]. E különbségek egyike a CD4 -et és CD8 -at expresszáló sejttípusokban van. Bár a CD8 minden fajban megtalálható a DC- és T -sejteken [24 25 26], csak patkányban és emberben fordul elő CD8 számos más immunsejtben. A jelenlegi bizonyítékok arra utalnak, hogy a CD8α fehérjét az NK-sejtek expresszálják patkányban [27] és emberben [28], de egérben [29] nem (1. táblázat és hivatkozások). Hasonlóképpen a patkány [42, 44] és a humán monociták [31] és a makrofágok [35] expresszálják a CD8α-t, és az egérben ugyanezek a sejtek hiányoznak a CD8α-ból [33]. Érdekes módon a patkány makrofágok és hízósejtek is CD8β -t expresszálnak [35, 36]. A CD8 -hoz hasonlóan, a patkányban és az emberben a CD4 -et a veleszületett immunsejt -típusok szélesebb skálája fejezi ki, mint az egerekben (1. táblázat és hivatkozásai). Érdekes módon a DC -k a CD4 expressziós mintázatában is eltérnek a fajok között: Az egér DC -k magas CD4 -szintet fejeznek ki, de az emberi és patkány DC -k alacsony szinten expresszálják a CD4 -et [26].

A CD4 és CD8 intracelluláris jelátvitelének aktiválásának mechanizmusai

A TCR jelátvitel különböző időbeli szakaszaiban a CD4 és CD8 a lipid raftokon belül vagy kívül működhet, hogy befolyásolja az intracelluláris jelátvitelt az lck-n vagy LAT-on keresztül. A TCR aktiválás egyik első lépése során a lipid tutajokon kívül elhelyezkedő CD45 defoszforilálja az lck -t. A CD4 és CD8 immunprecipitálódik a CD45-tel [45, 46], és részt vehet az lck korai lipid tutajtól független defoszforilezésében. A defoszforilezett lck ezután lipid tutajokba költözik, hogy két helyet foszforiláljon a CD3ζ -n. Az lck és/vagy CD4 és CD8 dinamikus palmitoilezése szabályozhatja az lck lipid raftokká történő átalakulását. Ezt követően a ZAP-70 foszforilezett CD3ζ-val toborozható. A ZAP-70 ezután képes foszforilálni a LAT-t, amely potenciálisan a CD4-hez és CD8-hoz kapcsolódik [12]. Ez a lipid tutajhoz kapcsolódó LAT az intracelluláris jelző komplexek állványhálózatát központosíthatja, közvetve toborozva az SLP-76-at TCR komplexekhez. Az SLP-76 a tirozin-kináz (NCK) nem katalitikus régióját toborozza, és lehetővé teszi a toborzott Itk aktiválását, hozzájárulva a PLCγ foszforilációjához és aktiválásához [47]. A PLCγ későbbi kötődése a LAT-hoz a Grb2-vel együtt erősen befolyásolja a kalciumfluxust, a citoszkeletális átrendeződést, a proliferációt és a géntranszkripciót [48].

Azon kívül, hogy az lck-n vagy LAT-on keresztül aktiválja az intracelluláris jelátvitelt, a CD8 befolyásolhatja a TCR-közvetített T-sejt-aktivációt az I. osztályú MHC-hez való extracelluláris kötődése révén. A TCR lassú asszociációs sebességgel köti meg az MHC-peptidet (10 3 –10 5 /Ms -1 ) , jellemző az indukált illeszkedési kötődésre [9], míg a CD8-nak a merev testkötésre jellemző gyorsabb asszociációs rátája van (1,4×10 5 /Ms −1) [49]. A CD8 -nak statisztikailag kapcsolatba kell lépnie az MHC I. osztályával egy apposztáló cellán a TCR előtt, amint azt a kísérleti adatok megerősítik [50]. A CD4 kötési kinetikája az I. osztályú MHC esetében kevésbé világos, de általában hasonlít a CD8 -hoz [9], ami arra utal, hogy hasonló modellek is alkalmazhatók rá. Érdekes, hogy az MHC I. osztály kétdimenziós kristályosítása lipidtutajokon azt sugallja, hogy az I. osztályú MHC fekvő helyzetben helyezkedhet el a plazmamembránon, a CD8-kötési helyet feltárva és a TCR-kötési helyet részben eltakarva [51]. Így az asszociációs arányok és a térbeli megfontolások azt sugallják, hogy a CD8 létrehozza az első kölcsönhatást az MHC I. osztályával, és növeli annak valószínűségét, hogy a TCR szkennelés és hajlítás az MHC I. osztály későbbi időpontjában történő produktív bekapcsolódásához vezet.


Következtetések

Ebben a tanulmányban az MRM MS és SEM méréseket két humán vérsejt-készítmény értékelésére használjuk, hogy optimális sejtreferenciaanyagokat keressenek a kvantitatív áramlási citometriához, amelyek stabilabbak és könnyebben karbantarthatók, mint a friss teljes vér. A liofilizálási folyamat miatt a Cyto-Trol sejtekből származó CD4+ limfociták CD4 sűrűségének értéke alacsonyabb, mint a mélyhűtéses PBMC-hez tartozó érték, ami nagy valószínűséggel a CD4 receptorfehérjék csonkításával és a sérült és/vagy törött mikrovillákkal magyarázható, ahol a CD4 receptorok találhatók. Másrészt az antitestek kötődésének sztérikus gátlása és a CD4 receptorok más biomolekulákkal való asszociációja valószínűleg jelentősen hozzájárul ahhoz, hogy az áramlási citometriával meghatározott mélyhűtött PBMC CD4 receptor sűrűsége közel 50%-kal alacsonyabb, mint az MRM MS-ből kapott érték.

A következetes CD4 expresszió T -sejteken normális donor PBMC -ben, amely biológiai kontrollként szolgál, növeli a klinikai diagnosztika és immunterápiák megbízhatóságát. Ez a CD4 receptor fehérje döntő szerepet játszik a HIV-1 vírusfertőzés progressziójában is, mivel a gp120 vírusfehérje kötődik a T-sejtek CD4 receptorához, ami a vírus bejutásához és a sejt széteséséhez vezet [15]. Noha számos erőfeszítést tettek a fertőzés elleni vakcinák kifejlesztésére, a siker korlátozott, nagyrészt a vírusfertőzési folyamat összetettsége és a kísérleti vakcinák mögöttes mechanizmusainak megértését támogató korlátozott robusztus mérési technikák miatt. A tanulmányban használt három hatékony technika, az áramlási citometria, az MRM MS és a pásztázó elektronmikroszkópia lehetővé tette számunkra, hogy jobban megértsük a CD4+ limfociták liofilizálási folyamata által okozott változásokat. Ezek a technikák lehetővé teszik a CD4-receptor sűrűségének és a CD4-ellenes monoklonális antitestek, például az ibalizumab [16] és a bispecifikus ibalizumab [17] számának mérését, amelyek CD4-receptorokat hordozó sejtekhez kötődnek. Ezek a mérések nagyban segítenének megvilágítani a HIV-1 kezelésére és megelőzésére szolgáló két kísérleti vakcina mögöttes mechanizmusait. Ezenkívül az irodalomban HIV-fertőzés egyes esetekben lefelé modulált CD4 sejtfelszíni expressziót és szubcelluláris lokalizációt [18], valamint a felszíni CD4 fehérje kimerülését [19] számoltak be. Minden bizonnyal nehezebb lenne ezeket a technikákat alkalmazni a különböző sejtrészekben lévő internalizált CD4 fehérjék mérésére.


EREDMÉNYEK

A CD4 és a CCR5 specifikus együttes kicsapódása a sejtvonalakból.

Korábban azt találták, hogy az oldható D1D2 fragmentum, de nem a CD4 teljes extracelluláris része zavarja a kemokin MIP-1α kötődését a CCR5-hez, jelezve a lehetséges kölcsönhatásokat a CD4 és a CCR5 között (11). Bár a CD4 két- és négydoménes fragmentumai közötti különbségek a kétdoménes CD4-fragmensben a konformációs epitópok jobb expozíciójának tulajdoníthatók, egy alternatív lehetőség az, hogy a CD4D1D2–CCR5 kölcsönhatás nem tükrözi a vad típusú (membránhoz kapcsolódó) CD4 kötődése a CCR5-höz. Ezért a nagy hatékonyság és reprodukálhatóság érdekében optimalizált immunprecipitációs vizsgálatot alkalmaztunk a natív membránhoz kapcsolódó CD4 és CCR5 közötti kölcsönhatások közvetlen kimutatására.

A sejtfelszínhez kapcsolódó CD4 és CCR5 együttes kicsapódásának demonstrálására 3T3 sejtvonalakat használtunk, amelyek CD4 (3T3.CD4), CD4 és CXCR4 (3T3.CD4.CXCR4) vagy CD4 és CCR5 (3T3.CD4.CCR5) kifejezésére transzfektáltak. A CD4-koncentrációk ezeknek a sejteknek a felszínén nagyon hasonlóak voltak: arányuk 1,26:1,2:1 volt, áramlási citometriával mérve (az adatok nem láthatók, lásd még az 1. ábrát).A, II. sáv). A CCR5 és CXCR4 felületi koncentrációja szintén nagyon hasonló volt (az áramlási citometriás adatokat nem mutatjuk be). Mivel a CD4-et könnyebb kimutatni Western-foltosítással és biotinilezéssel, mint a CCR5-vel, a legtöbb esetben anti-CCR5 antitesteket használtunk a CD4 koimmun-kicsapódására. Azt találtuk, hogy az N-terminálisra specifikus mAb 5C7 (29) volt a leghatékonyabb antitest a CCR5 immunprecipitációjában, összehasonlítva a többi anti-CCR5 antitesttel (az adatokat nem mutatjuk be). Ez az mAb együttesen kicsapta a felszínhez kapcsolódó CD4-et 3T3 sejtvonalakban, amelyek együtt expresszálják a CD4-et és a CCR5-öt (1. ábra)A, IV. sáv). A sáv CD4 volt, mert illeszkedik a CD4-sávhoz, amelyet közvetlen immunprecipitációval nyertünk anti-CD4 mAb (OKT4) alkalmazásával (1. ábra).A, II. sáv), a várt molekulatömeg (55 kDa), és specifikusan reagál a Western blot vizsgálatban (1. ábra).A, V sáv). A CD4 erősen és specifikusan dúsult a koimmunprecipitátumokban, amint azt az immunprecipitációnak nem kitett sejtfelszíni biotinilezett lizátumok összehasonlításával megfigyeltük (1. ábra).A, I. sáv) a koimmun -kicsapódásokkal (1. ábraA, IV. sáv). Ezekben a kísérletekben a CCR5 nem volt kimutatható a biotinilezés alacsony hatékonysága miatt, azonban Western-blot segítségével megfigyelték (1. ábra).A, VI sáv). Hasonló eredményeket kaptunk számos sejtvonal esetében, beleértve a PM1 és L1.2 transzfektánsokat, amelyek együtt expresszálnak CCR5-öt és CD4-et (az adatokat nem mutatjuk be).

A sejtfelszínhez kapcsolódó CD4 és CCR5 specifikus koimmunprecipitációja e két molekulát együtt expresszáló 3T3 sejtekből. (A) Egyenlő számú CDT -t és CCR5 -t (+) vagy csak CD4 -et ( -) expresszáló 3T3 -sejtet biotinileztünk, feldolgoztuk a Anyagok és metódusok, és vagy teljes sejt-lizátumként (a teljes mennyiség 0,25% -a, I gél) használják, vagy anti-CD4 mAb-vel (OKT4) (II gél), anti-CXCR4 mAb-vel (4G10) (gél III) vagy CCR5 mAb 5C7 (IV – VI gélek). A biotinilált fehérjék kimutatása sztreptavidin-torma peroxidáz (I-IV gél) alkalmazásával történt. A CD4-et és a CCR5-t ugyanazon minták alikvot részében mutatták ki, mint a IV. Gélben, Western-blot alkalmazásával anti-CD4 poliklonális antitesttel (T4-4) (gél V) vagy CCR5-ellenes poliklonális antitesttel [CKR5 (C20)] ( gél VI). (M jelentése molekuláris markerek, és a számok kDa -ban vannak megadva). (B) A CD4 együttes kicsapódása az m180 (1. sáv) és az m181 (2. sáv) anti-CCR5 mAb-kkel. A coimmun -kicsapódott CD4 -et és az immunprecipitált CCR5 -t Western Western blot módszerrel detektáltuk, A. (C) CCR5 együttes kicsapása 3T3.CD4.CCR5 sejtekből anti-CD4 antitestekkel. 3T3.CD4.CCR5 -sejteket (1., 2. és 4. sáv) vagy 3T3.CD4 -sejteket (3. sáv) használtunk immunprecipitációhoz OKT4 -vel (2. és 3. sáv) vagy kontroll -ellenanyaggal (CG10) (4. sáv). Az 1. sáv összehasonlítás céljából immunprecipitációt mutat be az anti-CCR5 mAb 5C7-tel. A CD4 -et és a CCR5 -t Western -blot alkalmazásával detektáltuk, ahogy az A. (D) A sejtlizátumokat az anti-CCR5 mAb 5C7 immunprecipitáltuk, az immunprecipitációs terméket ezüstfestő készlettel elemeztük (1. és 2. sáv), és összehasonlítottuk a sztreptavidin-torma peroxidáz által kimutatott fehérjékkel biotinilált lizátumokban (3. és 4. sáv). M jelentése molekulatömeg marker, + és - pedig 3T3.CD4.CCR5 vagy 3T3.CD4 sejtek. ∗, CD4 és CCR5 okozta sávok. A CD4 feletti és alatti két sávot az 5C7 mAb nehéz és könnyű lánca okozza. A 2. sáv az 1. sávot jelenti nagyobb érzékenység mellett, ahol a CCR5 jól látható. (E) A CD4–CCR5 koimmunprecipitációt nem befolyásolja szignifikánsan a koleszterincsökkenés. A 3T3.CD4.CCR5 sejteket 10 mM metil-β-ciklodextrinnel kezeltük 1 órán át 37 °C-on (ami jelentős citotoxicitást okozott), és immunprecipitációhoz használtuk az 5C7 anti-CCR5 antitesttel (2. sáv), és összehasonlítottuk a kezeletlen sejtekkel. (1. sáv) és 3T3.CD4 sejtek (3. sáv). A CD4 -et és a CCR5 -t Western -blot alkalmazásával detektáltuk, ahogy az A. Alsó a CD4 Western-blotolását mutatja a teljes sejt lizátumokból.

A CD4 koimmunprecipitáció specifikusságát több kontroll kísérlettel bizonyították. Az 5C7 elleni anti-CCR5 mAb nem adta együtt a CD4-et 3T3-ból. CD4 sejtek, amelyek nem expresszálják a CCR5-t (1. ábra)A, IV. és V. sáv). Egy másik kísérletben egy rokon kemokin receptor (CXCR4) elleni antitestet (4G10) használtunk. Ez az antitest képes hatékonyan immunprecipitálni a CXCR4 -et, és koimmunprecipitálni a CD4 -et és a CXCR4 -et a két molekulát expresszáló sejtekben (3. ábra).A), de nem koimmunoprecipitálta a CD4-et CD4-et és CCR5-öt expresszáló sejtekben (1. ábra).A, III sáv). Ezenkívül a koimmunoprecipitált CD4 mennyisége arányos volt az immunprecipitált CCR5 mennyiségével, amit két különböző immunprecipitáló aktivitású anti-CCR5 mAb alkalmazásával mutattunk ki (1. ábra).B), ami további specifikus CD4–CCR5 kölcsönhatásra utal. A CCR5-t egyidejűleg anti-CD4 antitesttel (OKT4) adtuk össze (1. ábra)C, 2. sáv), de nem kontroll -ellenanyaggal (CG10), amely nem kötődik a CD4 -hez (4. sáv), a két molekulát együtt expresszáló sejtekben (2. sáv), de nem a CCR5 negatív sejtekben (3. sáv).

A CD4 – CCR5 kölcsönhatás specifikásának további értékeléséhez és annak a kérdésnek a megválaszolásához, hogy más fehérjék kölcsönhatásba lépnek-e a CCR5-vel, és potenciálisan befolyásolják-e a CD4 – CCR5 asszociációt, a biotinilációval párhuzamosan az anti-CCR5 mAb 5C7 immunprecipitált fehérjék ezüstfestését használtuk. (Bizonyos fehérjéket, különösen a kemokin receptorokat a biotin rosszul jelöli, és alacsony koncentrációban előfordulhat, hogy nem észlelhetők). A CCR5-nek és CD4-nek megfelelő sávokon kívül csak azok a nagyobb sávok vannak, amelyek a kicsapó mAb 5C7 nehéz és könnyű láncait reprezentálják, és olyan sávok, amelyek látszólag nem specifikusak a CCR5-re, mivel immunprecipitálták őket CCR5-negatív sejtekben (3. 1D). Ezek az adatok nem csak azt sugallják, hogy a CD4 és a CCR5 közötti kölcsönhatást nem egy másik molekula közvetíti, hanem azt is jelzik, hogy a CD4 és a CCR5 együttes kicsapódása nem valószínű, hogy ennek a két molekulának a meghatározott membrán mikrodoméneken belüli felosztása miatt következik be, ami a koimmun -kicsapódáshoz vezetne nagyobb számú fehérje. Egy másik kísérlet, amely alátámasztja ezt az elképzelést, azt mutatja, hogy a sejtlízis két különböző detergenssel (Brij97 és NP40) nem zavarta meg a CD4–CCR5 kölcsönhatást (az adatokat nem mutatjuk be). Ezenkívül a koleszterin kiürítése a sejtmembránból metil-β-ciklodextrinnel, amely eljárásról kimutatták, hogy megzavarta a mikrodomén szerkezetét (lásd például a 30. hivatkozást), nem akadályozta meg a CD4 és a CCR5 együttes immunprecipitációját (1. ábra).E).

A CD4 és a CCR5 együttes kicsapódása primer CD4 + T -sejtekben, makrofágokban és monocitákban.

A fentebb sejtvonalakra vonatkozóan leírtakhoz hasonló eredményeket kaptunk a HIV-1 bejutásra érzékeny elsődleges humán sejtekkel is. Kezdeti kísérleteink a CD4 és CCR5 együttes immunprecipitálására a primer T-limfociták felszínéről nagyon gyenge sávokat eredményeztek, amelyek a vizsgálati érzékenység határán voltak, a CCR5 alacsony szintű expressziója e sejtek felszínén és a sejtek viszonylag kis százaléka miatt. áramlási citometriával értékelve kifejezve (az adatokat nem mutatjuk be). Két alternatív eljárást alkalmazva a CD4+ T-sejtek aktiválására, amint azt a Anyagok és metódusok, a CCR5 expressziója szignifikánsan emelkedett magas (+) és nagyon magas (++) szintekre, amelyek átlagosan ≈2–4 × 10 3, illetve 3–5 × 10 4 molekuláknak felelnek meg, kvantitatív áramlási citometriával becsülve. . Ezekben a sejtekben a CD4-szintek hasonlóak voltak, és az anti-CCR5 mAb-vel 5C7 együtt kicsapott CD4 mennyisége korrelált a sejtfúziós hatékonyságukkal (2. ábra).A). A humán makrofágokban és monocitákban a koimmunoprecipitált CD4 mennyisége szintén korrelált a HIV-1 JRFL Env-t expresszáló sejtekkel való fúzió hatékonyságával (2. ábra).B), de nem a CD4 felületi koncentrációjával. Valójában a monociták hasonló vagy magasabb szintű CD4-et expresszáltak, de a koimmunoprecipitált CD4 mennyisége nem vagy alig volt kimutatható a tesztünkben (2. ábra).B). A makrofágokban lévő nagyobb mennyiségű coimmun -kicsapódott CD4 valószínűleg a CCR5 magasabb szintjével van összefüggésben a monocitákkal összehasonlítva - átlagosan – 5–10 × 10 3 vs & lt2 × 10 3 molekula sejtenkénti mennyiségi áramlási citometria segítségével. A CCR5 szintje a makrofágokban azonban alacsonyabb volt a ++ CD4 + T -sejtekhez képest, és nem tudtuk kimutatni az immunprecipitált CCR5 -t Western blot segítségével (az adatokat nem mutatjuk be).

CD4 és CCR5 együttes immunprecipitációja primer sejtekben. (A) A humán CD4 T-sejteket, amelyek magas (+) és nagyon magas (++) mennyiségű CCR5-t expresszáltak, immunprecipitációra használtunk az 5C7-es anti-CCR5 mAb-vel (Központ) vagy fúzió a HIV-1 JRFL Env-t expresszáló HeLa-sejtekkel (Bal és Jobb). A koimmunban kicsapódott CD4 (Középső felső) és immunprecipitált CCR5 (Középső közép) Western blot alkalmazásával detektáltuk, mint az 1. ábránA. A teljes sejt-lizátumok CD4 Western-blot-ábrázolása látható (Alsó) a CD4 szintjének mérésére. A szinciák átlagos száma a ++ sejteknél 92 ± 10,5, a + sejtek esetében 29 ± 7, a kontroll HeLa sejteké 6 ± 3. A ++ sejtekből származó szinkritia átlagos átmérője körülbelül 4-szer nagyobb volt, mint a + sejtekhez. (B) Emberi makrofágok (Bal, 1. sáv) és a monociták (Bal, 2. sáv) CCR5 immunprecipitációhoz használtunk. A CD4 koimmunprecipitációt az alábbi módon mutattuk ki A. A teljes sejt lizátumok CD4 Western-blot-vizsgálata látható (Alsó) a CD4 szintjének mértékeként. (Jobb) Ezeknek a sejteknek a fúziója a HIV-1 JRFL Env-t expresszáló HeLa sejtekkel, a β-galaktozidáz vizsgálattal mennyiségileg meghatározva. A kontroll olyan HeLa sejteket képvisel, amelyek nem expresszálnak HIV-1 Env-t.

A CD4 és a CCR5 közötti kölcsönhatás erősebb, mint a CXCR4, és nem növekszik a gp120 jelenlétében.

Korábban azt találtuk, hogy a CD4 még gp120 hiányában is gyengén tud asszociálni a CXCR4-hez (10). Az eredmények azonban sejtvonal- és vizsgálati állapotfüggő módon változtak. A CD4 – CCR5 asszociáció CD4 – CXCR4 kölcsönhatáshoz viszonyított erősségének értékeléséhez 3T3 sejtvonalakat használtunk, amelyek CD4 -et és akár CCR5 -t, akár CXCR4 -et expresszáltak, közel azonos felületi koncentrációban. A 3T3.CD4.CXCR4 sejtekben a CD4 gyengén társult a CXCR4-hez, de az asszociáció drámaian megnövekedett X4 HIV-1 Env gp120 (IIIB) hozzáadásával (3. ábra)A). Ezzel szemben az anti-CCR5 mAb 5C7 által kicsapatott CD4 mennyisége a 3T3-ban. nem növelte jelentősen a CD4 – CCR5 koimmunprecipitációt (3. ábra) B és C). Az anti-CCR5 mAb-k által gp120 hiányában koimmunoprecipitált CD4 mennyisége körülbelül azonos volt az anti-CXCR4 mAb-k által gp120 jelenlétében koimmunoprecipitált CD4 mennyiségével. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a CD4 - CXCR4 asszociáció gyengébb, mint a CD4 - CCR5 kölcsönhatás, és hogy a CD4 és a CCR5 közötti előformázott komplexek közel vannak a telítettségi szinthez, ahol a gp120 hozzáadása nem növelheti tovább komplexképződésüket.

A gp120 hatása a CCR5 – CD4 és CXCR4 – CD4 asszociációra. (A) 3T3.CD4.CXCR4 sejteket inkubáltunk a 4G10 anti-CXCR4 mAb-vel HIV-1 IIIB gp120 hiányában (-) vagy jelenlétében (+) (5 μg/ml). A CD4-et és a CXCR4-et Western-blot alkalmazásával detektáltuk a poliklonális anti-CD4 Ab T4–4 vagy a 4G10 alkalmazásával. (B) A 3T3.CD4.CCR5 sejteket az 5C7 anti-CCR5 mAb-vel inkubáltuk HIV-1 89.6 gp120 hiányában vagy jelenlétében (5 μg/ml). A CD4-et és a CCR5-öt Western-blot segítségével detektáltuk az 1. ábrán leírtak szerintA. (C) Ugyanaz, mint itt B de az R5 HIV-1 JRFL gp120-at használták a kettős trópusi 89.6 helyett.

A CD4 első két doménje és a CCR5 második extracelluláris hurka valószínűleg részt vesz a CD4 – CCR5 komplex kialakításában.

A CD4 azon lehetséges régióinak azonosítására, amelyek felelősek a CCR5-tel való kölcsönhatásért, egy sejtvonalat (A2.01.T4.T8) használtunk, amely a CD4 első két doménjét tartalmazó hibrid CD4–CD8 molekulát expresszál, amelyről korábban kimutatták, hogy támogatja. HIV-1 Env által közvetített fúzió (31), bár kisebb arányban, mint a vad típusú CD4 (16). Az A2.01.T4.T8 sejteket a CCR5 expressziójára indukáltuk egy CCR5 gént kódoló rekombináns vaccinia vírussal. Ezek a sejtek, amelyek egyidejűleg expresszálják a CCR5-öt és a CD4-CD8 hibrid molekulát, összeolvadtak az R5 HIV-1 Env Bal-t expresszáló sejtekkel, bár valamivel alacsonyabb hatékonysággal, mint a vad típusú CD4-et expresszáló sejtek (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az eredmények hasonlóak az A2.01.T4.T8 sejtek és az X4 HIV-1 Env IIIB-t expresszáló sejtek közötti fúzióról szóló, korábban közölt megfigyeléseinkkel (16). A CD4–CD8 molekulákat a CCR5-öt expresszáló A2.01.T4.T8 sejtekből származó anti-CCR5 mAb-vel együtt immunprecipitáltuk, de a kontroll vad típusú vaccinia vírussal fertőzött sejtekből nem (4. ábra).A). A CCR5 és a vad típusú vaccinia vírussal fertőzött sejtekben a CD4–CD8 molekulák felszíni szintjei nem különböztek szignifikánsan, amint azt áramlási citometriával (az adatokat nem mutatjuk be) és Western blottal (4. ábra) határoztuk meg.B). Annak megállapítására, hogy a CD4–CD8 hibrid molekula CD8 része nem vett részt a CCR5-tel való kölcsönhatásban, CD4-et vagy CD8-at expresszáló HeLa sejteket használtunk. A CCR5-öt ismét expresszálta ezekben a sejtekben a rekombináns vacciniavírus. Ezekben a sejtekben csak a CD4-et, de nem a CD8-at anti-CCR5 mAb-vel (5C7) együtt kicsaptuk, ami azt mutatja, hogy a hibrid CD4 – CD8 molekula CD8 része valószínűleg nem vesz részt a CCR5-vel való kölcsönhatásban (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az eredmények együtt azt sugallják, hogy a CD4 első két doménje a CCR5 -hez kapcsolódik.

A CD4 első két doménjének és a CCR5 második extracelluláris hurkának részvétele a CD4-CCR5 asszociációban. (A) A CD4 első két doménjét tartalmazó CD4 – CD8 hibrid molekulák koimmunprecipitációja anti-CCR5 mAb segítségével. A hibrid CD4 – CD8 molekulát expresszáló A2.01.T4.T8 sejteket rekombináns vacciniavírussal (vvCCR5–1107) (1. sáv) fertőztük, amely a CCR5 génjét kódolta, és egy vad típusú (WR) vaccinia vírussal (2. sáv). Az 5C7 anti-CCR5 mAb-t a CCR5 és a T4–4 immunprecipitálására használtuk a CD4 Western blot módszerrel történő kimutatására. (B) A CCR5 (1. sáv) vagy WR (2. sáv) vacciniavírussal fertőzött A2.01.T4.T8 sejtekben a CD4–CD8 molekulák mennyisége nem különbözött szignifikánsan, amint azt az anti-CD4 Ab-vel (T4) végzett Western blot kimutatta. –4). (C) A CCR5 anti-CD4 mAb-vel (OKT4) való együttes kicsapódása gátolt egy másik anti-CD4 mAb (CG7) jelenlétében. Összehasonlításképpen: az 1. sáv az 5C7 által immunprecipitált CCR5 -öt mutatja. A 2., 3. és 4. sáv az OKT4 (3,5 μl/ml ascites folyadék) és az anti-CD4 mAb CG7 (0, 5 és 10 μg/ml) növekvő koncentrációjú keverékével együttesen kicsapott CCR5 mennyiségét jelzi. (D) Az 5C7 CD4 koimmun-kicsapódását gátolja egy másik anti-CCR5 mAb (2D7) (29) jelenlétében, amely a második extracelluláris hurokhoz irányul. Egyenlő mennyiségű (3 μg/ml) 5C7-et, amely nem befolyásolja a HIV-bejutást, összekeverték a HIV-1 növekvő mennyiségével (0, 3 és 6 μg/ml) (1., 2. és 3. sáv). - blokkolja a 2D7 mAb-t és immunprecipitációra használják. A 9 × 10 6 3T3. CD4.CCR5 sejtekből nyert mintát két részre osztottuk, és a kisebbiket (az összes 1/6 -át) a CD4 Western blot vizsgálatára használtuk T4–4, a többit pedig Western -re a CCR5 blotot a CKR5 (C20) segítségével. (E) A CCR5-terminálisra specifikus mAb 5C7 (2. sáv) sokkal hatékonyabban immunprecipitálja a CCR5-öt, mint a CCR5 ecl-2-specifikus mAb 2D7 (1. sáv). Ebből a két mAb-ből egyenlő mennyiséget (4 μg/ml) használtunk a CCR5 immunprecipitációjához 3T3.CD4.CCR5 sejtekben. A molekuláris markerek a jobb oldalon láthatók (M sáv). (F és G) Két anti-CCR5 mAb, az m182 és m183 (amelyek nem immunprecipitálják a CCR5-öt a mi vizsgálatunk szerint) differenciális gátlása a CCR5 együttes immunprecipitációjában az anti-CD4 mAb OKT4 által. Az 1., 2. és 3. sáv 1, 2 és 4 μg/ml m182 -t, illetve m183 -at jelent. A CCR5 -öt CKR5 -vel (C20) végzett Western -blottal detektáltuk.

Megerősítettük azt a korábbi megfigyelést is, hogy az első két doménből álló CD4 oldható fragmense (sCD4D1D2) verseng a makrofág gyulladásos fehérjével (MIP)1-α a CCR5-ért (11). Érdekes módon azt találtuk, hogy a CG7 mAb-t gátló HIV-1 fertőzés 60 nM-nél szinte teljesen blokkolta az sCD4D1D2 azon képességét, hogy kiszorítsa a kemokin MIP-1α-t (1. táblázat). Ugyanez az antitest szignifikánsan gátolta a CCR5 együttes immunprecipitációját az anti-CD4 mAb OKT4 által (4. ábra).C). A CG7-el ellentétben egy második anti-CD4 mAb (CG1) és egy kontroll mAb (CG10) nem voltak hatékonyak abban, hogy megakadályozzák a MIP1-α elmozdulását az sCD4D1D2 által (1. táblázat). Bár nem tudjuk, hogy az sCD4D1D2 jó modell -e a natív CD4 számára a CCR5 kötődés tekintetében, ezek az eredmények azt sugallják, hogy a CD4 bizonyos régiói, esetleg azok, amelyek átfedik a CG7 epitópját, valószínűleg az első CD4 doménen belül helyezkednek el (32) részt vesz a CCR5-tel való társulásban.

A MIP-1α CG7 kiszorításának gátlása

A CCR5 CD4-gyel kölcsönhatásba lépő régióinak lokalizálásához olyan mAb-k keverékét használtuk, amelyek felismerték a CCR5 N-terminálisát és első (ecl-1) és második (ecl-2) extracelluláris hurkát. A CCR5 (2D7) ecl-2-vel szembeni mAb koncentrációjának növelése az 5C7 keverékben csökkentette a coimmun-kicsapódott CD4 teljes mennyiségét (4. ábra)D), míg az immunprecipitált CCR5 mennyisége kissé megnőtt (4. ábra)D), valószínűleg a CCR5 2D7-tel történő további, de gyenge immunprecipitációjából ered (4. ábra).E). Another HIV-1-blocking mAb specific for the CCR5 ecl-2 (m182 R&D Systems) showed similar although weaker inhibitory effects (Fig. 4F) in contrast to the non-HIV-1-blocking anti-CCR5 mAb m183, which did not interfere with the CD4–CCR5 coimmunoprecipitation (Fig. 4G). Other mAbs to the N terminus and mAbs to ecl-1 of CCR5 did not decrease the amount of coimmunoprecipitated CD4 when used in combination with 5C7 (data not shown). These results suggest that the ecl-2 of CCR5 is involved in the interaction with CD4. However, even at the highest concentration of mAb (2D7) used (50 μg/ml), the inhibition of the CD4–CCR5 coimmunoprecipitation was not complete, indicating that regions additional to the second extracellular loop of CCR5 are probably involved in the interaction with CD4.

Membrane-Associated CD4 Colocalizes with CCR5.

We further examined whether the CD4 and CCR5 molecules associate by using confocal laser scanning microscopic analysis of fluorescently labeled molecules. Colocalization of the two molecules was observed as demonstrated by the yellow (red-green colocalization) staining, suggesting formation of large multimolecular complexes between these two molecules (Fig. 5). A correlation map was prepared by using software developed in this laboratory. The regions of true overlap of green and red staining were selected from the noncolocalized staining and the background fluorescence and represented as white dots. A relatively high degree of colocalization is evident from this analysis (Fig. 5 Alsó). Less colocalization was observed between CD4 and CXCR4 (Fig. 5 Bal) than with CCR5. It was previously shown that addition of X4 HIV-1 Env gp120 increases the colocalization of CD4 and CXCR4 (13). The extent of this increase appears to be comparable with the colocalization between CD4 and CCR5 in the absence of gp120 in a manner reminiscent of the immunoprecipitation data shown in Fig. 3. No significant colocalization was observed between CD45 and CCR5 or HLA class I and CCR5, suggesting specificity in the interaction between CD4 and CCR5 (data not shown). These results suggest that CCR5 (and to a lesser extent CXCR4) not only associates with native membrane-associated CD4 but that the two molecules form large multimolecular complexes possibly because of their dimeric structures (ref. 33, and data not shown).

Colocalization of CD4 and CXCR4 (Bal) or CCR5 (Jobb). A CXCR4 (or CCR5)-myc tag-expressing HeLa cell, double stained for CD4 (green) and CXCR4 (or CCR5) (red) (Felső). Colocalization of the two molecules is demonstrated by the yellow (red-green colocalization) staining, suggesting their clusterization. Correlation maps of these images (Alsó) show the regions of true overlap of green and red staining selected from the noncolocalized staining and the background fluorescence, represented as white dots.

Inhibition of the CD4–CCR5 Interaction Correlates with the Inhibition of HIV-1 Env-Mediated Fusion.

It has been demonstrated that the anti-CCR5 mAb 2D7 inhibits entry of R5 and R5X4 HIV-1 into U87MG-CD4 cells expressing transfected CCR5 (24). To investigate the possibility of a relationship between inhibition of the CCR5–CD4 interaction and HIV-1 Env-mediated fusion, we used a recombinant vaccinia virus-based reporter gene assay for quantitation of cell–cell fusion (19). The mAb 2D7 inhibited fusion between 3T3.CD4.CCR5 cells and cells expressing R5 (Bal and JRFL) and R5X4 (89.6) HIV Envs. The inhibition was concentration-dependent, and cell–cell fusion was significantly decreased at concentrations in the range of 0.5–50 μg/ml, a concentration range similar to that observed for inhibition of the CD4–CCR5 interaction (data not shown). For several other anti-CCR5 mAbs, there was correlation (r = 0.98, P = 0.001) between inhibition of fusion and inhibition of the CD4–CCR5 interaction (Table 2). These results indicate that the CD4–CCR5 interaction may play a role in membrane fusion mediated by the HIV-1 Env. However, as was similar to the inhibition of the CD4–CCR5 interaction, even at the highest mAb concentration used (50 μg/ml), the inhibition of fusion was not complete. The lack of complete inhibition of fusion suggests that multiple interactions, possibly both CD4–CCR5 and gp120–CCR5, and multiple interaction sites involving other extracellular regions of CCR5, are involved in the initial steps of HIV-1 entry.

Correlation between inhibition of HIV-1 (Bal)-mediated fusion and CD4–CCR5 interactions by anti-CCR5 mAbs


Anyagok és metódusok

Cell-culture reagents

Cells were cultured in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM l -glutamine, 50 μg/mL gentamicin, 1 mM sodium pyruvate, and 1% nonessential amino acids (complete medium). DCs were stimulated with 1 μg/mL lipopolysaccharide (LPS Escherichia coli 0111:B4 Sigma Chemical, Saint Louis, MO) CD154-transfected J558L cells at a ratio of 4:1 and 5 μM cytosine phosphate guanosine (CpG) oligonucleotide 2216 type A or CpG oligonucleotide 2006 type B (InvivoGen, San Diego, CA). CD4 + T cells were stimulated with anti–human CD3 mAb (clone TR66). Crystalline 1,25(OH)2D3 was a gift of Milan Uskokovic (BioXell, Nutley, NJ), dexamethasone was purchased from Sigma Chemical, and recombinant human (rh) IL-10 from PharMingen (San Diego, CA).

Cell purification

Peripheral-blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from buffy coats by Ficoll gradient (Pharmacia Biotec AB, Uppsala, Sweden). Peripheral-blood myeloid DCs (M-DCs) and plasmacytoid DCs (P-DCs) were magnetically sorted with blood dendritic-cell antigen-1 (BDCA-1) and BDCA-4 cell-isolation kits (Miltenyi Biotec, Bergish Gladblach, Germany), respectively, as described, 27 to a purity of 95% to 98% in both cases. DC subsets were analyzed either immediately or after culture in complete medium in the presence of 10 ng/mL recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) or 20 ng/mL IL-3 (Pharmingen), respectively. To generate immature monocyte-derived DCs, monocytes, obtained from PBMCs by positive selection with CD14 beads (Miltenyi Biotec), were grown for 6 to 7 days in complete medium plus 10 ng/mL rhGM-CSF and 10 ng/mL IL-4 (PharMingen). CD4 + T cells were purified from PBMCs by negative selection with CD4 T-cell-isolation kit (Miltenyi Biotec), and CD4 + CD25 + T cells were subsequently positively selected with CD25 beads (Miltenyi Biotec).

Flow cytometric analysis

Flow cytometric analysis was performed as previously described, 7 in the presence of 100 μg/mL mouse IgG, using the mAbs anti-CD1c (BDCA-1) fluoroscein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE), anti–BDCA-2 FITC or PE (Miltenyi Biotec), anti-CD1a FITC/PE, and anti-CD83 FITC/PE, all from Pharmingen, or with mAbs specific for ILT1 (clone 135.1), ILT2 (clone GHI75), ILT3 (clone ZM3.1), ILT4 (clone 42D.1), and ILT5 (clone 7H5). Cells were analyzed with an LSR flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA) using CellQuest software (Becton Dickinson).

T-sejt aktiválás

Peripheral-blood DC subsets were cultured for 5 days in complete medium and for an additional 7 days in the presence of CD4 + T cells with or without 20 μg/mL anti-ILT3 antibody. Intracellular cytokine production by CD4 T-cell lines was analyzed as described. 28 CD4 + T cells were cultured in 96-well flat-bottom plates with graded amounts of immature monocyte-derived DCs, which had been cultured for the last 48 hours with or without 10 nM 1,25(OH)2D3. The coculture of DCs and T cells was carried out in the presence or absence of anti-ILT3 mAb. After 5 days of culture, interferon-γ (IFN-γ) production was measured by 2-site enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Alternatively, CD4 + T cells were cultured in the presence of immature monocyte-derived DCs (ratio, 1:10) with or without anti-ILT3 and 7 to 10 days after primary stimulation, were restimulated under the same conditions. After 2 rounds of stimulation, CD4 + T cells were cultured in 96-well round-bottom plates precoated by overnight incubation with anti–human CD3 mAb. After 72 hours, cytokine production was quantified by 2-site ELISA. Paired mAbs specific for IFN-γ, IL-4, and IL-10 (Pharmingen), were used as described. 7 The detection limit for all cytokines was 15 pg/mL.

Suppression assay

The read-out system was composed of CD4 + CD25 – cells from donor A PBMCs labeled with Vybrant CFDA (carboxyfluorescein diacetate) succinimidyl ester (SE) cell tracer kit (Molecular Probes, Leiden, the Netherlands) and cultured in the presence of 1:10 LPS-matured monocyte-derived DCs from donor B. To evaluate the induction of regulatory T cells, graded amounts of CD4 + T cells from donor C were generated by 3 rounds of restimulation with allogeneic immature monocyte-derived DCs from donor D, which were cultured for the last 48 hours with or without 1,25(OH)2D3. The coculture was carried out with or without anti-ILT3 mAb (20 μg/mL). The suppression assay was performed in the presence of 1 μg/mL anti–human CD3 mAb. After 72 to 96 hours of culture, cells were recovered and analyzed with an LSR flow cytometer (Becton Dickinson) using CellQuest software.

Real-time quantitative RT-PCR

RNA was extracted using Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer's instruction, followed by a cleanup with the RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Reverse transcription (RT) was performed, and real-time quantitative RT–polymerase chain reaction (PCR) of total cDNA using specific primers was carried out using an ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) and Taqman chemistry. The primers used are commercially available from Applied Biosystems as assays on demand. Relative quantification of target cDNA was determined by arbitrarily setting the control value to 1 and changes in cDNA content of a sample were expressed as a multiple thereof. Differences in cDNA input were corrected by normalizing to β actin or GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) signals. To exclude amplification of genomic DNA, RNA samples were treated with DNAse (Sigma Chemical).

Immunohistology

Skin biopsies were obtained from untreated psoriatic plaques or from psoriatic lesions of 5 patients treated topically for 30 days with 0.005% calcipotriol cream (Psorcutan Schering, Milan, Italy) twice daily, or for 20 days with 0.1% mometasone furoate cream (Elocon Schering-Plough, Milan, Italy) twice daily, and snap-frozen in liquid nitrogen. Immunohistology was performed on 5-μm-thick cryostat sections fixed in acetone and dried overnight, as described. 29 Before incubation with specific mAbs or control isotype mouse Ig's, sections were hydrated for 10 minutes with 0.05 M Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane)–aminomethane saline buffer (TBS), pH 7.6, and incubated for 10 minutes with a mixture of normal human AB serum and normal rabbit serum (20% in TBS), to minimize nonspecific staining. Then, after washing in TBS, the sections were incubated for 30 minutes with specific mAbs, followed by polyclonal rabbit antimouse serum diluted 1/30 in TBS (Dako-Patt, Copenhagen, Denmark) and alkaline phosphatase anti–alkaline phosphatase complex diluted 1/50 in TBS (Dako-Patt). Finally, stainings were revealed using new fucsin (75 μL of a new fucsin–sodium-nitrite solution) in 10 mL of 0.05 M TBS, pH 8.7 5 mg naphthol AS-BI (7-bromo-3-hydroxy-2-naphtho- o -anisidine) sodium salt and 1 mM levamisole (Sigma Chemical). Sections were counterstained with Mayer haematoxylin, washed in water, and dried at room temperature before mounting. Slides were observed with a Leica light microscope (DMR Leica Microsystems, Milan, Italy) equipped with an HC Plans 10×/2.2 ocular and an N plan 20×/0.40 objective lens.

Immunofluorescent stainings were performed on 5-μm-thick frozen sections from skin biopsies of calcipotriol-treated psoriatic plaques. After fixing for 15 minutes in 4% paraformaldehyde and blocking with 0.1 M glycine for 10 minutes at room temperature, slides were incubated overnight at 4°C in blocking solution with affinity-purified rabbit anti–mouse CD11c (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), washed 5 times with wash buffer (0.45 M NaCl, 0.24 M Na2HPO4, 0.24 M NaH2PO4, and 0.3% Triton X-100), and incubated for 60 minutes with polyclonal antirabbit FITC (Sigma Chemical). Alternatively, slides were incubated overnight at 4°C with biotinylated rat anti–mouse CD123 (Jackson Immunoresearch) followed by Rhodamine Red-X-streptavidin (Jackson Immunoresearch). Negative controls were performed by incubation with appropriate isotype-matched primary antibodies. The slides were then washed again and mounted with 90% glycerol/phosphate-buffered saline (PBS). Slides were analyzed with an MRC-1024 laser-scanning confocal microscope (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Images were acquired and processed with Laser Sharp 3.2 software (Bio-Rad).

1,25(OH)2D3 enhances ILT3 expression on DCs. Monocyte-derived human DCs were incubated for 48 hours with medium alone or containing 10 nM 1,25(OH)2D3 or 10 ng/mL IL-10, either when immature or during LPS-induced (100 ng/mL) maturation. Surface expression of the indicated ILT molecules was determined by cytofluorimetry. Histograms represented by broken lines show staining with an isotype control those with thick lines show staining with the indicated anti-ILT mAbs. Geometric mean fluorescence intensity (MFI) values are shown in the top right corner. A representative experiment out of 6 performed is shown.

1,25(OH)2D3 enhances ILT3 expression on DCs. Monocyte-derived human DCs were incubated for 48 hours with medium alone or containing 10 nM 1,25(OH)2D3 or 10 ng/mL IL-10, either when immature or during LPS-induced (100 ng/mL) maturation. Surface expression of the indicated ILT molecules was determined by cytofluorimetry. Histograms represented by broken lines show staining with an isotype control those with thick lines show staining with the indicated anti-ILT mAbs. Geometric mean fluorescence intensity (MFI) values are shown in the top right corner. A representative experiment out of 6 performed is shown.


Authorship

Contribution: J.M.M. designed and performed experiments, analyzed results, made figures, and wrote the manuscript B.R.L. designed experiments, participated in discussion of the results, and reviewed the paper J.E.S.-C. designed experiments and reviewed the paper A.J.C. performed experiments and reviewed the paper V.A.Y. performed experiments L.C.N., J.M., and D.F.N. participated in discussion of the results and reviewed the paper and L.L.L. participated in discussion of the results and edited the paper.

Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing financial interests.


Vita

A novel anti-TLR5 monoclonal antibody, ACT5, revealed the cell surface expression of TLR5 on immune cells. The recruitment of TLR5 to the cell surface was completely dependent on TLR-specific chaperone PRAT4A. In Ba/F3 cells, PRAT4A physically associated with TLR5. PRAT4A knock-down resulted in marked suppression of NF-κB activation in response to flagellin. In addition, in a macrophage cell line J774, PRAT4A silencing abolished cell surface expression of endogenous TLR5 and flagellin-dependent cytokine production. These results suggest that PRAT4A-dependent cell surface expression of TLR5 is required for flagellin-induced cytokine production. Previous studies report that PRAT4A associates with a general chaperone gp96 and restricts gp96 client to TLRs ( 21). Taken together with the requirement of gp96 for flagellin response ( 20), the present results demonstrate that TLR5 is another client of the chaperone complex PRAT4A–gp96.

It is well established that TLR5 activates MyD88-dependent signaling pathways to induce cytokine production and DC maturation ( 4, 12). While cell surface TLR2/4-signaling requires a ‘sorting adaptor’, TIRAP, to recruit MyD88 to the cell surface TLR ( 17), a previous report demonstrated that TLR5 does not need TIRAP for cytokine production ( 16). Here, we confirm that TLR5 is another cell surface TLR, suggesting that MyD88 pathway from cell surface does not necessarily require TIRAP. TIRAP-independent MyD88 signaling from cell surface TLR5 may be a reason why flagellin, in contrast to LPS, is poor inflammatory and less relation to severe organ failure ( 37).

ACT5 revealed highly restricted expression of TLR5 on in vivo immune cells. Cell surface TLR5 was mainly detected on neutrophils, Ly6C hi classical monocytes, splenic CD8 − CD4 + /CD8 − CD4 − cDCs, splenic pDCs and CD11b hi CD11c hi lamina propria DCs. In acute inflammatory lesion, neutrophils and monocytes are swiftly recruited from the circulation and have a role in primary defense against microbial organisms. Neutrophils, Ly6C hi and Ly6C low monocytes infiltrated into the peritoneal cavity 12h after thioglycollate injection. Cell surface expression of TLR5 was detected on neutrophils and Ly6C hi classical monocytes, but not on Ly6C low monocytes. At 72h after thioglycollate injection, almost all exudate cells were TLR5 − Ly6C low monocytes. These findings indicate that cell surface TLR5 is one of the hallmarks of innate immune cells that are recruited early in inflammation.

All TLRs except TLR3 are expressed in human neutrophils and induce cytokine release, superoxide generation and CD62L shedding ( 38). However, neutrophils from mouse BM or an inflammatory lesion did not produce cytokines in response to flagellin despite the expression of TLR5 on the cell surface. Given a role for TLR5 in phagocytosis and ROS production ( 39), cell surface TLR5 in neutrophils may principally contribute to direct pathogen clearance rather than to cytokine production.

Based on cell surface markers, mice monocytes are subcategorized into two major subsets ( 40). The Ly6C hi CCR2 hi CX3CR1 low subset is called classical monocytes, which are recruited to a site of tissue injury or infection via CCR2-signaling and differentiate into macrophages or DCs. The other Ly6C low CCR2 low CX3CR1 hi subset, nonclassical monocytes, has a remarkable patrolling activity and gives rise to resident macrophages after entering tissues. This study showed that TLR5 is expressed on Ly6C hi , but not on Ly6C low monocytes in the BM, circulation and inflammatory lesions. Flagellin is able to induce IL-6 and MCP-1 production via cell surface TLR5 from Ly6C hi monocytes, suggesting that classical monocytes are one of the main sources of flagellin-induced cytokines in acute inflammation. Considering that Ly6C hi classical monocytes contributes to the gut immune system and have a role in protection against an enteric bacterium ( 41), flagellin-induced cytokines from classical monocytes have an important role in augmenting acute inflammation at mucosa.

In addition to neutrophils and classical monocytes, very restricted expression of cell surface TLR5 was also found in DCs. First, cell surface TLR5 was detected on CD8α − cDCs, but not on CD8α + cDCs, in the spleen. CD8α − cDCs are more potent in activating CD4 + helper T cells than CD8α + cDCs, and associate with induction of Th2-type response ( 42). Considering that flagellin has been shown to have the potent adjuvant activity with a tendency to induce Th2 response ( 12, 28), CD8α – cDCs, but not CD8α + cDCs, are likely to be required for the adjuvant activity of flagellin. Unexpectedly, splenic plasmacytoid DCs (pDCs), which is specialized to secrete large amounts of type I interferon, also express cell surface TLR5. As one report suggests that flagellin can induce IFN-β from BM-macrophages ( 43), flagellin may induce or augment the production of type I interferon in pDCs.

Against oral infection with a flagellated pathogen, TLR5 has a role in mounting adaptive immune responses ( 10, 36). CD11b hi CD11c hi DCs in the lamina propria express TLR5 mRNA and have a key role in activating flagellin-dependent adaptive immune responses. Consistent with these previous reports, our results showed that only CD11b hi CD11c hi DCs expressed TLR5 on the cell surface. In contrast to these in vivo DCs, TLR5 is barely detectable on BM-DCs. Similarly, TLR5 is detectable on Ly6C hi monocytes in vivo but not on BM-macrophages. These results reveal that BM-derived DCs/macrophages are distinct from in vivo DCs/macrophages. Unlike TLR2 and TLR4/MD-2, in vitro maturation induced by GM-CSF or M-CSF does not accompany cell surface expression of TLR5, implying that a signal is missing in in vitro maturation that induces cell surface TLR5.

In summary, our results show that TLR5 is expressed on the cell surface of neutrophils, classical monocytes and specific subpopulations of DCs, in a PRAT4A-dependent manner. The present result, however, does not necessarily exclude the possibility that intracellular TLR5 is functional. Although BM-DCs did not express cell surface TLR5, BM-DCs could respond to flagellin and induce DC maturation ( 12, 35). In the case of TLR4/MD-2, intracellular TLR4/MD-2 in BM-macrophages is responsible for upregulation of costimulatory molecules and certain chemokine production ( 22). Future studies need to focus on TLR5 inside the cells.

Japanese-Korean Cooperative Programme on Basic Medical Research Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology for Program of Japan Initiative for Global Research Network on Infectious Diseases Grant-in-Aid for Scientific Research (B), grant reference 21117001 Grant-in-Aid for Exploratory Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, grant reference 23790526.

Classical monocytes, but not neutrophils, are the predominant source of flagellin-induced cytokines. (A) Gating strategies to sort neutrophils and classical monocytes from BM cells by Gr-1 and Ly6G staining. Red dots mean total CD11b + BM cells. Overlaid blue and green dots on red dots mean Ly6C int Ly6G + neutrophils and Ly6C hi Ly6G - classical monocytes, respectively (left dot plots). Since neutrophils and classical monocytes matched to Gr-1 hi Ly6G + and Gr-1 hi Ly6G – population (right dot plots), respectively, these populations were sorted and used for cytokine assay. (B and C) Sorted classical monocytes (B) and neutrophils (C) from BM cells were stimulated by 100ng ml –1 flagellin and cytokine production was analyzed by ELISA. Asterisks mean no signals were detected.

Classical monocytes, but not neutrophils, are the predominant source of flagellin-induced cytokines. (A) Gating strategies to sort neutrophils and classical monocytes from BM cells by Gr-1 and Ly6G staining. Red dots mean total CD11b + BM cells. Overlaid blue and green dots on red dots mean Ly6C int Ly6G + neutrophils and Ly6C hi Ly6G - classical monocytes, respectively (left dot plots). Since neutrophils and classical monocytes matched to Gr-1 hi Ly6G + and Gr-1 hi Ly6G – population (right dot plots), respectively, these populations were sorted and used for cytokine assay. (B and C) Sorted classical monocytes (B) and neutrophils (C) from BM cells were stimulated by 100ng ml –1 flagellin and cytokine production was analyzed by ELISA. Asterisks mean no signals were detected.