Információ

3.6.5: Gázvezikulák – Biológia


TANULÁSI CÉLOK

  • Beszélje meg a gázvezikulumok szerepét a túlélésben.

A gázvezikulák néhány planktonbaktériumban található orsó alakú struktúrák, amelyek felhajtóerőt biztosítanak ezeknek a sejteknek azáltal, hogy csökkentik azok általános sejtsűrűségét. Pozitív felhajtóerőre van szükség ahhoz, hogy a sejtek a vízoszlop felső szakaszában maradjanak, hogy továbbra is folytathassák a fotoszintézist. Fehérjehéjból állnak, amelynek erősen hidrofób belső felülete van, így vízállóvá teszi (és megakadályozza a vízgőz becsapódását), de a legtöbb gáz számára áteresztő. Mivel a gázvezikula üreges henger, hajlamos összeomlani, ha a környező nyomás túl nagy lesz.

A természetes szelekció finomhangolta a gázvezikulák szerkezetét, hogy maximalizálja a kihajlással szembeni ellenállását azáltal, hogy egy külső erősítő fehérjét, a GvpC-t tartalmaz, mint a fonott tömlőben lévő zöld szál. Egyszerű összefüggés van a gázvezikula átmérője és a nyomás között, amelynél összeesik – minél szélesebb a gázvezikula, annál gyengébb lesz. A szélesebb gázvezikulák azonban hatékonyabbak. Fehérjeegységenként nagyobb felhajtóerőt biztosítanak, mint a keskeny gázvezikulák. A különböző fajok különböző átmérőjű gázhólyagokat termelnek, lehetővé téve számukra, hogy a vízoszlop különböző mélységein kolonizálják (gyorsan növekvő, erősen versenyképes fajok széles gázvezikulákkal a legfelső rétegekben; lassú növekedésű, sötéthez alkalmazkodó, erős keskeny gázvezikulákkal rendelkező fajok a mélyebb rétegek). A gázhólyag átmérője abban is segít meghatározni, hogy mely fajok maradnak életben a különböző víztestekben. A téli keveredést tapasztaló mély tavak a teljes vízoszlop által generált hidrosztatikus nyomásnak teszik ki a sejteket. Ez a keskenyebb, erősebb gázhólyaggal rendelkező fajokat választja ki.

Főbb pontok

  • Ezek egy olyan fehérjehéjból állnak, amelynek belső felülete erősen hidrofób, így vízáteresztő (és megakadályozza a vízgőz lecsapódását), de a legtöbb gáz számára átjárható.
  • A természetes szelekció finomhangolta a gázvezikula szerkezetét, hogy maximalizálja a kihajlással szembeni ellenállását, beleértve a külső erősítő fehérjét, a GvpC-t, mint a fonott tömlőcső zöld fonalát.
  • A gázhólyag átmérője abban is segít meghatározni, hogy mely fajok maradnak életben a különböző víztestekben.

3.6.5: Gázvezikulák – Biológia

Az MDPI által közzétett összes cikk azonnal hozzáférhetővé válik világszerte nyílt hozzáférésű licenc alapján. Az MDPI által közzétett cikk egészének vagy egy részének - beleértve az ábrákat és táblázatokat - újrafelhasználásához nincs szükség külön engedélyre. A nyílt hozzáférésű Creative Common CC BY licenc alatt közzétett cikkek esetében a cikk bármely része engedély nélkül újrafelhasználható, feltéve, hogy az eredeti cikkre egyértelműen hivatkoznak.

A Feature Papers a legfejlettebb kutatásokat képviseli, amelyek jelentős potenciállal rendelkeznek a területen. A tématerveket a tudományos szerkesztők egyedi meghívására vagy ajánlására nyújtják be, és a közzététel előtt szakértői értékelésnek vetik alá.

A Feature Paper lehet eredeti kutatási cikk, jelentős új kutatási tanulmány, amely gyakran több technikát vagy megközelítést is magában foglal, vagy átfogó áttekintő dokumentum, amely tömör és pontos frissítéseket tartalmaz a terület legújabb fejlődéséről, és amely rendszeresen áttekinti a tudományos izgalmasabb eredményeket. irodalom. Ez a fajta papír kitekintést nyújt a kutatás jövőbeli irányaira vagy a lehetséges alkalmazásokra.

A Editor's Choice cikkei a világ minden tájáról származó MDPI folyóiratok tudományos szerkesztőinek ajánlásain alapulnak. A szerkesztők kiválasztják a folyóiratban nemrég megjelent cikkeket, amelyek véleményük szerint különösen érdekesek lesznek a szerzők számára, vagy fontosak ezen a területen. A cél az, hogy pillanatfelvételt nyújtsunk a folyóirat különböző kutatási területein közzétett néhány legizgalmasabb munkáról.


A gázvezikulumok elsősorban a vízi élőlényekben fordulnak elő, mivel a sejt felhajtóerejének módosítására és a sejt vízoszlopban való elhelyezkedésének módosítására szolgálnak, hogy optimálisan elhelyezkedhessen a fotoszintézishez, vagy több vagy kevesebb oxigént tartalmazó helyekre költözzön. [1] Azok a szervezetek, amelyek a levegő -folyadék határfelületre úszhatnak, felveszik a versenyt más aerobokkal, amelyek nem tudnak emelkedni a vízoszlopban a felső réteg oxigénfelhasználása révén.

Ezenkívül a gázvezikulák felhasználhatók az optimális sótartalom fenntartására azáltal, hogy a szervezetet meghatározott helyekre helyezik el egy réteges vízben, hogy megakadályozzák az ozmotikus sokkot. [2] Az oldott anyag nagy koncentrációja ozmózis útján vizet von el a sejtből, ami sejtlízist okoz. A gázvezikulák szintetizálásának képessége egyike azoknak a stratégiáknak, amelyek lehetővé teszik a halofil szervezeteknek, hogy tolerálják a magas sótartalmú környezetet.

A gázvezikulák valószínűleg az egyik legkorábbi motilitási mechanizmus a mikroszkopikus szervezetek között, mivel ez a prokarióták genomjában megőrzött mozgékonyság legelterjedtebb formája, amelyek közül néhány körülbelül 3 milliárd évvel ezelőtt alakult ki. [3] [4] Az aktív mozgékonyság olyan módjai, mint a zászlók mozgása, olyan mechanizmust igényelnek, amely képes átalakítani a kémiai energiát mechanikai energiává, és így sokkal összetettebb, és később alakult volna ki. A gázvezikulumok funkciói is nagyrészt konzerváltak a fajok között, bár a szabályozás módja eltérő lehet, ami arra utal, hogy a gázvezikulumok fontos szerepet játszanak a mozgékonyságban. Bizonyos szervezetekben, például enterobaktériumban Serratia sp. A flagella-alapú motilitást és a gázvezikulum-termelést ellentétben egyetlen RNS-kötő fehérje, az RsmA szabályozza, ami a környezethez való alkalmazkodás alternatív módjaira utal, amelyek a motilitás és a flotáció közötti fejlődés szabályozása révén különböző taxonokká fejlődtek volna. [5]

Bár vannak bizonyítékok a gázvezikulák korai evolúciójára, a plazmidtranszfer alternatív magyarázatként szolgál az organellum széles körben elterjedt és konzervált természetére. [4] Egy plazmid hasítása a Halobacterium halobium a gázvezikulák bioszintetizálásának képességének elvesztését eredményezte, ami a vízszintes géntranszfer lehetőségét jelzi, ami azt eredményezheti, hogy a különböző baktériumtörzsek között átmegy a gázvezikulák képződésének képessége. [6]

D) Ramsay et al. (2011), a kiadó engedélyével.

A gázhólyagok általában citrom alakú vagy hengeres, üreges fehérjecsövek, mindkét végén kúpos kupakkal. A hólyagocskák átmérőjükben változnak leginkább. A nagyobb vezikulák több levegőt képesek befogadni és kevesebb fehérjét használnak fel, így a leggazdaságosabbak az erőforrás -felhasználás szempontjából, azonban minél nagyobb egy vezikulum, az szerkezetileg gyengébb, és nyomás alatt van, és annál kisebb nyomás szükséges a vezikula összeomlása előtt. Az élőlények a fehérjehasználat során a leghatékonyabbakká fejlődtek, és a legnagyobb maximális hólyagátmérőt használják, amely ellenáll a szervezet által kifejtett nyomásnak. Annak érdekében, hogy a természetes szelekció hatással legyen a gázvezikulákra, a hólyagok átmérőjét genetikailag kell szabályozni. Bár a gázhólyagokat kódoló gének sok haloarchaea-fajban megtalálhatók, csak néhány faj termeli őket. Az első haloarchaeális gázvezikula gént, a GvpA-t Halobacterium sp. NRC-1. [7] 14 gén vesz részt a gázvezikulák kialakításában a haloarchaea -ban. [8]

Az első gázvezikula gént, a GvpA-t a Calothrix-ben azonosították. [9] Legalább két fehérje alkotja a cianobaktérium gázvezikulumát: a GvpA és a GvpC. A GvpA bordákat és a fő szerkezet tömegének nagy részét (akár 90%-át) képezi. A GvpA erősen hidrofób, és az egyik leghidrofób ismert fehérje lehet. A GvpC hidrofil, és segít stabilizálni a szerkezetet a GvpA bordákba való időszakos zárványokkal. A GvpC képes kimosódni a hólyagból, és ennek következtében csökken a hólyag erőssége. A hólyag falának vastagsága 1,8-2,8 nm között változhat. A hólyag bordázott szerkezete mind a belső, mind a külső felületeken jól látható, a bordák közötti távolság 4-5 nm. A hólyagok 100-1400 nm hosszúak és 45-120 nm átmérőjűek lehetnek.

Egy fajon belül a gázvezikulák mérete viszonylag egyenletes, ±4%-os szórással.

D) Pfeifer (2012) és (E) Shapiro et al. (2014), a kiadó engedélyével.

Úgy tűnik, hogy a gázvezikulumok kis bikónikus (két kúp, lapos bázisok egymással összekapcsolva) szerkezetekként kezdik létezni, amelyek a meghatározott átmérőre nőnek, majd nőnek és hossza megnő. Nem ismert, hogy pontosan mi szabályozza az átmérőt, de lehet, hogy egy molekula zavarja a GvpA-t, vagy a GvpA alakja megváltozhat.

A gázvezikulák képződését két Gvp fehérje szabályozza: a GvpD, amely elnyomja a GvpA és GvpC fehérjék expresszióját, és a GvpE, amely expressziót indukál. [10] Az extracelluláris környezeti tényezők is befolyásolják a hólyagképződést, akár a Gvp fehérjetermelés szabályozásával, akár a vezikula szerkezetének közvetlen megzavarásával. [8] [11]

Fényintenzitás Szerk

Azt találták, hogy a fényintenzitás eltérően befolyásolja a gázvezikulák termelését és fenntartását a különböző baktériumok és archeák között. For Anabaena flos-aquae, a nagyobb fényintenzitás a turgornyomás növekedése és a fotoszintetikus termékek nagyobb felhalmozódása következtében a hólyagok összeomlásához vezet. A cianobaktériumokban a hólyagtermelés nagy fényintenzitás mellett csökken, mivel a baktériumfelület UV sugárzásnak van kitéve, ami károsíthatja a baktérium genomot. [11]

Szénhidrátok Szerkesztés

Glükóz, maltóz vagy szacharóz felhalmozódása Haloferax mediterranei és Haloferax volcanii kimutatták, hogy gátolják a GvpA fehérjék expresszióját, és ezáltal csökkentik a gázvezikulák termelését. Ez azonban csak a sejt korai exponenciális növekedési fázisában következett be. A hólyagképződés indukálható az extracelluláris glükózkoncentráció csökkenésében is. [12]

Oxigén szerkesztés

Azt találták, hogy az oxigénhiány negatívan befolyásolja a gázvezikulák képződését a halofil archeákban. Halobacterium salinarum anaerob körülmények között alig vagy egyáltalán nem termelnek vezikulákat a Gvp fehérjéket kódoló mRNS transzkriptumok csökkent szintézise miatt. H. mediterranei és H. volcanii nem termelnek vezikulákat anoxikus körülmények között a GvpA -t kódoló szintetizált átiratok és a GvpD -t kifejező csonkolt átiratok csökkenése miatt. [12]

PH Szerkesztés

Azt találták, hogy a megnövekedett extracelluláris pH-szint növeli a vezikulák képződését a Microcytis fajokban. Megnövekedett pH mellett a szint gvpA és gvpC a transzkriptumok növekednek, ami lehetővé teszi a riboszómák expressziójának fokozottabb expozícióját, és a Gvp fehérjék felszabályozásához vezet. Ennek oka lehet ezeknek a géneknek a nagyobb transzkripciója, a szintetizált átiratok bomlásának csökkenése vagy az mRNS nagyobb stabilitása. [13]

Ultrahangos besugárzás Szerkesztés

Azt találták, hogy az ultrahangos besugárzás bizonyos frekvenciákon összeomlja a gázvezikulákat a cianobaktériumokban Spirulina platensis, megakadályozva virágzásukat. [14]

Kvórum érzékelés Szerk

Ban ben enterobacterium Serratia sp. ATCC39006 törzs, gázvezikula csak akkor keletkezik, ha megfelelő koncentrációban van egy jelzőmolekula, az N-acil homoszerin lakton. Ebben az esetben a kvórumérzékelő molekula, az N-acil-homoszerin-lakton morfogenként működik, amely beindítja az organellák fejlődését. [5] Ez előnyös a szervezet számára, mivel a gázvezikulák termeléséhez szükséges erőforrásokat csak akkor hasznosítják, ha a baktériumpopuláció növekedése miatt oxigénhiány áll fenn.

Gáz vezikulum gén gvpC-től Halobacterium sp. oltóanyagként használják vakcina vizsgálatokhoz.

A gázvezikulum -gén által kódolt fehérje számos jellemzője gvpC lehetővé teszi antigének hordozójaként és adjuvánsként történő alkalmazását: stabil, ellenáll a biológiai lebomlásnak, viszonylag magas hőmérsékletet (50 ° C-ig) tolerál, és nem patogén az emberekre. [15] Több antigént különböző emberi kórokozókból rekombináltak a gvpC gén hosszú távú immunológiai válaszokkal rendelkező alegység vakcinák létrehozásához. [16]

Különböző genomi szegmensek kódolnak több Chlamydia-fertőzés a kórokozó fehérjéi, köztük a MOMP, az OmcB és a PompD, kapcsolódnak a gvpC génje Halobaktériumok. In vitro a sejtek felmérései a Chlamydia gének expresszióját mutatják a sejtfelületeken képzelési technikákon keresztül, és jellegzetes immunológiai válaszokat mutatnak, mint például a TLR aktivitások és a gyulladást elősegítő citokinek termelése. [17] A gázvezikula gént szállító hordozóként lehet kihasználni a Chlamydia elleni potenciális vakcina előállítására. Ennek a módszernek a korlátai közé tartozik, hogy minimálisra kell csökkenteni a GvpC fehérje károsodását, miközben a vakcina célgénjének minél nagyobb részét be kell vonni gvpC génszegmens. [17]

Hasonló kísérletben ugyanazt a gázvezikula gént és Salmonella enterica a patogén által kiválasztott inozin -foszfát -effektor fehérje SopB4 és SopB5 potenciális vakcinavektor létrehozásához. Az immunizált egerek IFN-γ, IL-2 és IL-9 proinflammatorikus citokineket választanak ki. Antitest IgG is kimutatható. A fertőzés után egyetlen vagy lényegesen kevesebb baktériumot sem találtak a begyűjtött szervekben, például a lépben és a májban. A gázvezikulumot antigénmegjelenítésként használó potenciális vakcinák a nyálkahártyán keresztül adhatók be alternatív beadási módként, így több ember számára elérhető, és szélesebb körű immunválaszt váltanak ki a szervezetben. [15]

A gázvezikulák számos fizikai tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek láthatóvá teszik őket a különböző orvosi képalkotási módokon. [18] A gázvezikulák fényszóró képességét évtizedek óta használják koncentrációjuk becslésére és összeomlási nyomásának mérésére. A gázvezikulák optikai kontrasztja lehetővé teszi számukra, hogy kontrasztanyagként szolgálhassanak az optikai koherencia tomográfiában, a szemészetben. [19] Az akusztikus impedancia különbsége a magjukban lévő gáz és a környező folyadék között erőteljes akusztikus kontrasztot ad a gázvezikuláknak. [20] Ezenkívül egyes gázvezikuláris héjak csatra való képessége harmonikus ultrahang visszhangot generál, ami javítja a kontrasztot a szövetek arányával. [21] Végül a gázvezikulák kontrasztanyagként használhatók mágneses rezonancia képalkotáshoz (MRI), a levegő és a víz mágneses szuszceptibilitása közötti különbségre támaszkodva. [22] A gázhólyagok nem invazív összeomlásának képessége nyomáshullámok segítségével mechanizmust biztosít jelük törléséhez és kontrasztjuk javításához. Az akusztikus összeomlás előtti és utáni képek kivonása megszüntetheti a háttérjeleket, ami javítja a gázhólyagok észlelését.

A gázvezikulák heterológiai expressziója bakteriális [23] és emlős [24] sejtekben lehetővé tette ezek használatát az akusztikus riportergének első családjaként. [25] Míg a fluoreszcens riporter géneket, például a zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) széles körben használták a biológiában, in vivo Az alkalmazásokat korlátozza a fény behatolási mélysége a szövetekben, általában néhány mm. A lumineszcencia a szöveten belül mélyebben is kimutatható, de térbeli felbontása alacsony. Az akusztikus riporter gének szubmilliméteres térbeli felbontást és több centiméteres behatolási mélységet biztosítanak, lehetővé téve a in vivo a szövet mélyén zajló biológiai folyamatok tanulmányozása.


A gázhólyagok méreteinek mérése elektronmikroszkóppal

Grant J. Jensen, Biológiai és Biológiai Mérnöki Osztály, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Kémiai és Vegyészmérnöki Osztály, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, CA 91125.

Kémiai és Vegymérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, California, USA

Grant J. Jensen, Biológiai és Biológiai Mérnöki Osztály, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Kémiai és Vegyészmérnöki Osztály, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, CA 91125.

Kémiai és Vegymérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, California, USA

Kémiai és Vegymérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, California, USA

Biológiai és Biológiai Mérnöki Tanszék, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, Kalifornia, USA

Biológiai és Biológiai Mérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, California, USA

Beckman Intézet, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, Kalifornia, USA

Biológiai és Biológiai Mérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, California, USA

Kémiai és Vegymérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, California, USA

Biológiai és Biológiai Mérnöki Tanszék, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, Kalifornia, USA

Kémiai és Biokémiai Tanszék, Brigham Young Egyetem, Provo, Utah, USA

Grant J. Jensen, Biológiai és Biológiai Mérnöki Osztály, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Kémiai és Vegyészmérnöki Osztály, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, CA 91125.

Kémiai és Vegymérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, California, USA

Grant J. Jensen, Biológiai és Biológiai Mérnöki Osztály, Kaliforniai Technológiai Intézet, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Kémiai és Vegymérnöki Osztály, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Támogatási információk: Caltech Center for Environmental Microbial Interactions Heritage Medical Research Institute National Institutes of Health, Grant/Award Numbers: R01-EB018975, R35-GM122588 Packard Fellowship for Science and Engineering Pew Scholarship in the Biomedical Sciences

Absztrakt

A gázvezikulák (GV-k) hengeres vagy orsó alakú fehérje nanoszerkezetek, amelyeket levegővel töltenek meg, és különböző cianobaktériumok, heterotróf baktériumok és Archaea által flotációra használnak. A közelmúltban a GV -k érdeklődést mutattak a biotechnológiai alkalmazások iránt, mivel képesek képalkotó szerekként és működtetőként szolgálni az ultrahanghoz, a mágneses rezonanciához és számos optikai technikához. A GV -k átmérője kulcsfontosságú paraméter, amely hozzájárul mechanikai stabilitásukhoz, felhajtóerő funkciójukhoz és a gazdasejtek evolúciójához, valamint tulajdonságaikhoz a képalkotó alkalmazásokban. Fontossága ellenére az azonos típusú GV bejelentett átmérői eltérnek az értékeléshez használt módszertől függően. Itt magyarázatot adunk ezekre az eltérésekre, és elektronmikroszkópos (EM) technikákat alkalmazunk a leggyakrabban vizsgált GV -típusok átmérőjének pontos becslésére. Megmutatjuk, hogy az EM rácson történő levegőszárítás során a GV -k ellapulnak, ami a

látszólagos átmérőjük 1,5-szeresére nő. Bemutatjuk, hogy a GV-k átmérője pontosan meghatározható a krio-EM mintákból származó közvetlen mérésekkel, vagy közvetve a lapos összeomlott és negatívan festett GV szélességéből. Eredményeink segítenek megmagyarázni a korábban közölt adatok következetlenségét, és pontos módszereket kínálnak a GV méretek mérésére.


Eredmények

Két különböző módszert alkalmaztunk a fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára. Az első megközelítés a cellulóz-kötő domént címkeként használó lehúzható kísérlet volt, a második pedig a split-GFP volt az interakciós partnerek azonosítása. in vivo.

Lehúzható kísérletek a cellulóz kötési tartomány használatával

A GvpF és a GvpM kiegészítő fehérjék feltételezett kölcsönhatásait lehúzható kísérletekkel vizsgálták a cellulózkötő domén, a CBD használatával, lehetővé téve a címkézett fehérjék számára, hogy magas sókoncentrációban (2 és#x20133 M KCl) megkötjék a cellulózt (Ortenberg és Mevarech, 2000, Irihimovitch és Eichler) , 2003 Schlesner és mtsai, 2012). A CBD-t az egyes járulékos Gvp N- vagy C-terminálisaihoz fuzionáltuk a pCBD vektorplazmid segítségével (1. kiegészítő ábra). A kapott CBDX vagy XCBD konstrukciókat (X = bármely kiegészítő GvpF -GvpM) használtuk az átalakításhoz Haloferax volcanii WR340. Annak tesztelésére, hogy a CBD-fúziós fehérjék valóban tisztíthatók-e 2 M KCl-ben, a megfelelő lizátumok CBDAz X transzformánsokat cellulózhoz keverve kötöttük a CBD-vel jelölt Gvp-t, és az elúciós frakciókat SDS-PAGE-val, valamint Western-analízissel vizsgáltuk a különböző Gvp-fehérjék ellen termelt antiszérumok alkalmazásával (2. kiegészítő ábra). A GvpJ és a GvpM kivételével a kiegészítő Gvp-t megfelelő mennyiségben izolálták (1. táblázat), és jól láthatóak a Coomassie-festett gélekben (2. kiegészítő ábra). A GvpJ -t és a GvpM -et sokkal kisebb mennyiségben szerezték be, feltehetően hidrofób jellegük és aggregálódásuk miatt. GvpJ és GvpM aggregátumai jelen lehetnek a sejtkivonatok szilárd frakciójában, és a DDM (n-dodecil-β-D-maltozid) vagy OGP (oktil-β-D-glükopiranozid) detergens hozzáadása. A lizátumhoz és a mosópufferhez való adagolás kismértékben javította ezeknek a fehérjéknek a jelenlétét az oldható frakcióban (1. táblázat). Az összes kiegészítő Gvp fehérje, beleértve a GvpJ-t és a GvpM-et, kimutatható volt Western-analízissel (2. kiegészítő ábra). A nagyobb sávok kenése mindig kimutatható a GvpJ -vel, ami azt jelzi, hogy képes aggregálódni (2. kiegészítő ábra). Így mindegyik a CBDA Gvp fehérjéket kiválasztottuk és tisztíthattuk. Annak biztosítására, hogy a címkézetlen Gvp ne lépjen kölcsönhatásba sem a cellulózmátrixszal, sem a CBD-vel, transzformánsokat állítottunk elő, amelyek tartalmazták a pCBD plazmidokat (anélkül, hogy gvp) és pX ex (gvpX-pJAS35, amely bármely gvp nélkül cbd fúzió). A vizsgált Gvp -proteinek egyike sem volt kimutatható a megfelelő elúciós frakcióban, ami azt mutatja, hogy egyikük sem kötődött cellulózhoz vagy magához a CBD -hez (az adatokat nem mutatjuk be).

Asztal 1. Összege CBDA Gvp-t 400 ml-es tenyészetből CBD-vel nyertük ki.

A CBD-címkével ellátott Gvp fehérjéket csaliként használták, és tesztelték az ugyanabban a sejtben termelt feltételezett Gvp interakciós partner kiválasztására. Az első tesztelt fehérjepár a GvpL/GvpM volt, ahol kölcsönhatást mutattak ki His-címkézett Gvp fehérjék használatával. A GvpL vagy a GvpM CBD-t hordozott az N- vagy C-terminálishoz (CBDL, LCBD vagy CBDM, MCBD), és a kombinációk CBDL/M, LCBD/M, CBDM/L és MCBD/L elemezték. Lizátumok CBDL/M és LCBDA /M transzformánsokat GvpM jelenlétére teszteltük, és ennek a fehérjének a monomereit és dimerjeit Western-analízissel azonosították (3. kiegészítő ábra). Ezenkívül a GvpL jelen volt az elúciós frakciókban CBDM/L és MCBD/L transzformánsok, amelyek azt jelzik, hogy a GvpL megkötötte a GvpM-et (3. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények megerősítették a GvpL/GvpM interakciót, amelyet már láttak a megfelelő His-jelzett Gvp fehérjék és egy Ni-NTA mátrix segítségével az affinitáskromatográfiához (Tavlaridou et al., 2014).

Hasonló lehúzási kísérleteket végeztek a CBD-vel az összes többi kiegészítő Gvp fehérjével. Az illető Hfx. vulkánok A transzformánsok mindig két konstrukciót hordoztak, az egyiket a csalifehérjéhez (CBDX), és egy a GvpY prédának (X, Y = F, G, H, I, J, K, L vagy M). Mind a csalit, mind a zsákmányt kódoló olvasókereteket az alábbiakban fejeztük ki Pfdx a promóter szabályozása a hasonlóan magas expresszió biztosítására. Nem minden lehetséges interakciót hajtottak végre mindkét módon (CBDX+Y és CBDY+X), mivel a fehérje interakciókat már találták egy fehérjepárral. E vizsgálatok eredményeit az 1. ábra és az összefoglaló 2. táblázat mutatja be. Az 1. ábrán látható Western-blotokat a prédafehérje kimutatására használt antiszérum szerint rendeztük el. Használata CBDX a GvpM kiválasztásához monomer GvpM-et eredményezett CBDH, és monomerek, valamint dimerek CBDF, CBDG, CBDJ, CBDK, és CBDL (1. ábra). A GvpM dimerjeit és multimereit figyelték meg CBDI (1. ábra). Így a GvpM ezekben az esetekben le lett húzva. A GvpL -t választotta CBDF, de a kapott eredményeket CBDH vagy CBDKétértelmű voltam (1. ábra). Azonban amikor CBDL-t használtuk csaliként, a GvpM-et, a GvpK-t, a GvpJ-t vagy a GvpG-t ismét kiválasztottuk, ami arra utal, hogy ezek a kiegészítő Gvp kötötte a GvpL-t. Ezenkívül a GvpK kölcsönhatásba lép a Gvp kiegészítőkkel, mivel CBDF keresztül CBDJ és CBDL lehúzott GvpK, és CBDK helyreállította a GvpM-et. A GvpJ monomerjeit a CBDX, de további GvpJ multimereket tartalmazó kenetet találtak CBDF, CBDH, CBDÉN, CBDL, ill CBDM (1. ábra). A GvpI -t csak csaliként használták, és CBDLehúztam a kiegészítő Gvp fehérjék bármelyikét. Érdekes megjegyezni, hogy CBDGyakran indukáltam nagyobb oligomerek kialakulását, különösen GvpM, GvpK vagy GvpJ zsákmányként. A GvpH -t választotta CBDF vagy CBDÉn és CBDH lehúzta a GvpG, GvpJ, GvpK, GvpL vagy GvpM fájlokat (1. ábra és 2. táblázat). GvpG monomereket és dimereket választott ki CBDF, míg CBDH, CBDén és CBDL kiválasztotta a GvpG dimerjét (és további multimereket is CBDI) (1. ábra). Mivel CBDG kötötte a GvpM-et, a GvpK-t és a GvpJ-t, ezek az eredmények azt mutatták, hogy a GvpG képes kölcsönhatásba lépni az összes járulékos fehérjével. Hasonló eredményeket kaptunk a GvpF esetében, mivel a GvpF-et lehúzta CBDÉn és CBDF lehúzta a GvpG-t, a GvpH-t és a GvpJ-t a GvpM-en keresztül (1. ábra és 2. táblázat). Összességében ezeknek a lehúzható kísérleteknek az eredményei azt sugallták, hogy bármely kiegészítő Gvp-nek több interakciós partnere volt, és azt sugallták, hogy ezek a fehérjék nagyobb komplexet alkothatnak.

1.ábra. Western-analízisek a lehúzható vizsgálatok segítségével CBDX. A csali CBDX és az Y zsákmányfehérjét (X, Y = bármely GvpF a GvpM fehérjén keresztül) ugyanabban a szintetizáltuk Hfx. vulkánok sejt. Mindkettő a blotok tetején van megjelölve. Csak a cellulózmátrix elúciós frakciója látható. Mindegyik esetben az elúciós frakció 15 µl-ét SDS-PAGE-val elválasztottuk, a fehérjéket PVDF membránra vittük át, és az alatta jelzett megfelelő antiszérummal inkubáltuk (㬟-től αM-ig). A feltételezett interakciós partnereket az IRDye 800 CW (Licor) fluoroforral jelölt másodlagos antitesttel tettük láthatóvá. A blotokat fekete-fehérre fordítjuk, és a megfelelő antiszérum szerint rendezzük el. A nyilak jelzik a várható Gvp monomert és dimert. A bal oldali számok méretjelzők kDa-ban.

2. táblázat. A lehúzható kísérletek összefoglalása a CBDGvp.

Kiegészítő Gvp fehérjék Válogatott CBDM

Annak megvizsgálásához, hogy a GvpM képes volt-e egyszerre kiválasztani az összes kiegészítő Gvp-t, Hfx. vulkánok transzformánsokat hordozva állítottak elő CBDM és ezen kívül a pF-L ex expresszáló plazmid gvpFGHIJKL az erős alatt Pfdx promóter vezérlés. Az interakciós partnerek CBDAz M-et lehúzó kísérletekkel választottuk ki ennek a transzformánsnak a lizátumából, és a mintákat Western-analízissel teszteltük különböző antiszérumok felhasználásával (2. ábra). Minden kiegészítő Gvp azonosításra került, ami arra utal CBDM mindegyiket vonzotta. Minden esetben a megfelelő monomer Gvp-t detektáltuk. A GvpG esetében két 30 � kDa sáv volt látható a várt 10 kDa GvpG fehérje mellett, és a GvpJ és a GvpK is multimereket alkotott (2. ábra). A monomer a CBDM csalifehérjét is kimutattunk (2. ábra). Átfogó, CBDM le tudta húzni a GvpF-et a GvpL-en keresztül. Lehetséges, hogy ezen Gvp fehérjék mindegyike függetlenül kötődik CBDM, de az is lehetséges, hogy néhány vagy mindegyik komplexet alkotott, amely a GvpM-hez kötődik.

2. ábra. által kiválasztott fehérjék nyugati elemzései CBDM in CBDM/pF-L ex transzformánsok. Minden esetben, 15 & # x03BCL az elúciós frakciót választottunk el SDS-PAGE-, átvittük PVDF-membránra, és inkubáljuk a megfelelő antiszérummal jelölt alatta (& # x03B1F keresztül & # x03B1M). A reakciókat az IRDye 800 CW (Licor) fluoroforral jelölt másodlagos antitesttel tettük láthatóvá. A nyilak jelzik a várt észlelt Gvp monomert. A foltokat fekete-fehérre fordítottuk. A bal oldalon lévő számok méretjelzők kDa-ban.

A fehérje-fehérje kölcsönhatásokat a Split-GFP vizsgálta

A kiegészítő Gvp fehérjék páros kölcsönhatásait tanulmányozták Hfx. vulkánok in vivo split-GFP módszerrel. Minden egyes gvp Az olvasási keretet PCR -rel amplifikáltuk, és beillesztettük a négy vektor plazmidba, hogy összeolvadhassunk ngfp- vagy cgfp olvasási keretet mindegyik 5′ vagy 3′ végéhez gvp (Winter et al., 2018). Az N- és C-terminális GFP fragmensek, az NGFP és a CGFP a sóhoz adaptált, zöld fluoreszcens fehérjéből, az mGFP2-ből származnak (Born és Pfeifer, 2019). A fluoreszkáló GFP csak akkor képződik, ha a két fúziós partner kölcsönhatásba lép, és nem következik be a sztérikus akadály. Az egyes fúziós fehérjék leolvasási keretét a Pfdx promóter szabályozással, hogy hasonlóan nagy mennyiségű ilyen fehérjét kapjunk. A négy N/CGFP fúziót jelöltük ki NX, vagy CX az N-terminális fúzióhoz, és XC vagy XN a C-terminális fúzióhoz Gvp-vel (X = megfelelő tartozék Gvp C = CGFP N = NGFP). Egy fehérjepár nyolc kombinációját tesztelték Hfx. vulkánok A transzformánsokat és a fluoreszcenciát tetszőleges fényelnyelő egységben mértük mm 2 -enként. Az egyes kölcsönhatáspárokra számított legmagasabb relatív fluoreszcenciát (rf-értékeket) a 4. kiegészítő ábra mutatja, a LAU/mm 2 -ben kapott eredeti adatokat pedig az 5. kiegészítő ábra mutatja be. Ezen adatok összefoglalása a 3. ábrán látható.

3. ábra. A kiegészítő Gvp kölcsönhatásai a split-GFP alapján. (A) A legmagasabb relatív fluoreszcencia (rf-értékek) a fehérje-fehérje kölcsönhatásokra meghatározva, a módszerek részben leírtak szerint. Minden kísérletet két biológiai és három technikai ismétléssel végeztünk. (B) A split-GFP által meghatározott különböző fehérje-fehérje kölcsönhatások összefoglalása. A tesztelt Gvp fehérjék a bal oldali szürke mezőben láthatók, és interakciós partnereik a legmagasabb meghatározott rf-érték szerint vannak elrendezve (alul megadva). Az rf > 5 értéket meghaladó fluoreszcenciát egyértelmű kölcsönhatásnak tekintették. Az Rf-értékek és a#x003C rf 4 gyenge vagy nincs kölcsönhatás.

Az összes kölcsönhatás közül a legmagasabb relatív fluoreszcenciát a NG/CL transzformáns (rf 77,5), amely a GvpL és a GvpG közötti erős kölcsönhatást jelzi (3A. Ábra). A GvpL összes többi interakciós partnere 20 alatti rf-értéket adott. 10 és 20 közötti Rf-értékeket figyeltek meg az F kölcsönhatásraC/NL, NI/LC, MC/LN, HN/LCés JC/NL és rf 7,4 volt meghatározva K-reC/NL (3A., B. ábra és 5. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a 32 kDa-s GvpL kölcsönhatásba lépett az összes többi kiegészítő Gvp-vel. A GvpL a Gvp tartozékok közül a legnagyobb, és platformként szolgálhat a többiek megkötéséhez. Ezenkívül a GvpF kölcsönhatásba lép számos Gvp fehérjével (GvpL, GvpH, GvpI és GvpG) (3B. ábra). Az FC/LN a transzformáns (rf 16,6) mutatta a legmagasabb relatív fluoreszcenciát, míg a másik három kötőpartner alacsonyabb rf-értéket adott (rf 5,0𠄶,3). A GvpF esetében meg kell említeni, hogy a legnagyobb fluoreszcenciát mindig akkor figyeltük meg, amikor az N- vagy CGFP-t a GvpF C-terminálisához olvadtunk, ami arra utal, hogy az N-terminális fúzió akadályozza az mGFP2 összeszerelését. A 23 kDa-os GvpF kisebb, mint a GvpL, de mindkét fehérje szekvencia-hasonlóságot és hasonló 3D-struktúrát mutat, ha a cianobaktérium GvpF kristályszerkezetét templátként modellezzük (Xu et al., 2014 Winter et al., 2018).

Az összes kombináció második legnagyobb fluoreszcenciáját (rf 20) figyeltük meg a H esetébenC/NI transzformáns (3. ábra), ami arra utal, hogy a GvpH és a GvpI vonzzák egymást. Mindkét fehérje kölcsönhatásba lépett a GvpF -el és a GvpL -lel is (rf 6.3). Két partnerfehérjét azonosítottak a GvpG -re (GvpL és GvpF), és úgy tűnt, hogy a GvpL az egyetlen interakciós partner a három fehérje GvpJ, GvpK és GvpM között (3B. Ábra). Összességében ezek az osztott GFP elemzésekkel kapott eredmények azt mutatták, hogy az összes kiegészítő Gvp fehérjében legalább egy másik Gvp fehérje volt interakciós partner. Mivel a GvpL mindegyiket megkötötte, lehetséges, hogy egy nagyobb komplexet alkotnak. Az affinitáskromatográfiával kapott eredményekhez képest a CBDGvp, kevesebb kölcsönhatást figyeltek meg a split-GFP-vel, különösen a két hidrofób fehérje, a GvpJ (12 kDa) és a GvpM (9,2 kDa), valamint a GvpK (12,6 kDa) esetében.

A GvpA interakciós partnere(i).

A fő szerkezeti gázvezikula fehérje GvpA és ezen járulékos Gvp közötti kölcsönhatások feltárása érdekében az A/X (X = GvpF-től GvpM-ig) minden egyes kombinációját split-GFP-vel vizsgáltuk. A GvpA-t az N- vagy C-terminálison fuzionáltattuk N- vagy CGFP-vel, és páronként teszteltük a GvpF megfelelő N/CGFP fúziós variánsaival a GvpM-en keresztül. Minden párnál nyolc különböző kombinációt vizsgáltunk, és az egyes esetekben számított legmagasabb rf-értékeket a 4A ábra mutatja. Az ezekben a kísérletekben kapott eredeti adatokat a 6. kiegészítő ábra mutatja be. A legmagasabb relatív fluoreszcenciát az A esetében kaptuk.C/FN transzformáns (rf 20), míg az összes többi transzformáns < 1 rf-értéket adott, ami nagyon gyenge érintkezésre utal a GvpA és a többi Gvp fehérje között (4A. ábra). Kivéve NA/LC, a fehérjepár legnagyobb fluoreszcenciáját mindig akkor figyeltük meg, amikor az N- vagy CGFP-t a GvpA C-terminálisához fuzionálták. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GvpF a GvpA egyetlen interakciós partnere, és hogy a GvpA N-terminális régiója részt vehet a kölcsönhatásban.

4. ábra. Split-GFP interakciós vizsgálatok GvpA/GvpX segítségével. Csak az egyes kombinációkra meghatározott legmagasabb relatív fluoreszcenciát adjuk meg. Minden esetben két biológiai és három technikai ismétlést végeztünk. (A) A GvpA és a nyolc járulékos fehérje, GvpF a GvpM kölcsönhatás vizsgálata. (B) Öt különböző GvpA fragmentum kölcsönhatása GvpF-fel. (C) Az öt GvpA fragmentum szekvenciája a felül látható GvpA aa szekvenciához képest. A sorozat feletti számok a GvpA aa pozícióit ábrázolják. A 㬑 és 㬒 spirálok, valamint a β lapok 㬡 és 㬢 vastag betűvel vannak jelölve, alul pedig szürkék.

To define the interaction site of GvpF in GvpA more precisely, five GvpA fragments harboring different structural features (according to the model obtained by Strunk et al. (2011)) were studied by split-GFP. Fragment A1-22 encompasses the first 22 amino acids of GvpA including α-helix 1 (㬑), fragment A1-34 contains in addition β-sheet 1 (㬑-㬡), and A1-43 the 㬑-㬡-㬢 elements of GvpA (Figure 4C). Fragment A20-47 contains 㬡-㬢, and A44-76 the α-helix 2 up to the C-terminus of GvpA (㬒) (Figure 4C). Each of these GvpA fragments was fused at the N- or C-terminus to N- or CGFP and tested with the respective N/CGFP fusion of GvpF. Transformant FN/A1-22C yielded the highest fluorescence (rf 41), i.e., more than twice as high as obtained for the interaction of GvpF with the entire GvpA (rf 20) (Figure 4B). Smaller protein fragments offer less steric hindrance supporting the interaction (Ghosh et al., 2000 Winter et al., 2018). An increased fluorescence was also found for the transformants harboring F/A1-34 and F/A1-43 (rf 33 – 35), whereas a very low relative fluorescence (rf < 1) was obtained for the transformants harboring F/A20-47 or F/A44-76. These results implied that the C-terminal portion of GvpA is not involved, and that the N-terminal portion contains the interaction site of GvpF.

To further confine the interaction site of GvpF in GvpA, various substitution variants of GvpA were tested by split-GFP. Many of these point mutations in GvpA are known to influence the formation of gas vesicles in 㥊+Amut transformants (Strunk et al., 2011 Knitsch et al., 2017). These transformants carry two vector plasmids, the 㥊 construct (contains except gvpA összes gvp genes of the p-vac region) and construct A (gvpA or mutant gvpA expressed in pMDS20 under the control of the native PA promoter). The different GvpA variants were investigated by split-GFP analysis for their potential to interact with GvpF in Hfx. volcanii. Az FN fusion protein was used as interaction partner in all these cases (Figure 5A). The strongest reductions in relative fluorescence (rf < 6) compared to GvpA wild type (rf 15-18) were observed for the GvpA substitutions G20D, G20A, D24A, D24Y, R28A, R28D, or E40A, but also R15A, K19D, A27E, or G33V resulted in a low relative fluorescence of the F/Amut transformants (Figure 5A and Supplementary Figure 6). Especially the charged aa in 㬡 and 㬢 (D24, R28, E40) and G20 of GvpA had a strong influence on the interaction with GvpF (Figure 5). All these aa are located in the N-terminal half of GvpA, whereas any of the single substitutions in the C-terminal half had no effect on the interaction with GvpF, supporting the results described above. It is likely that these aa of GvpA are involved in the GvpF/GvpA interaction. In respect to the gas vesicle phenotype of the 㥊+Amut transformants, most of these mutations result in a Vac – phenotype, except for D24A (cylindrical) and R28A (mini gas vesicles) (Knitsch et al., 2017 Figure 5B). It is possible that the Vac – phenotype is caused by the lack of an interaction between GvpF and GvpA, rather than (or in addition to) an influence of the mutation on the GvpA/GvpA contact in the gas vesicle wall.

5. ábra. Split-GFP studies of GvpF and variants of GvpAmut. (A) Rf-values of the GvpF/GvpA (WT) and the various F/Amut transformants. The single substitutions in GvpA are indicated below. F/Amut transformants with relative fluorescence φ are labeled in blue. The fluorescence was determined in LAU/mm 2 , and the relative fluorescence in relation to the fluorescence of Hfx. volcanii wild type calculated. Two biological and three technical replicates were performed in each case. (B). Sequence of GvpA and summary of the rf-values of the various GvpA mutants. The sequence of GvpA is presented on top and the structural features 㬑–㬡–㬢–㬒 shaded in grey. The substitutions in GvpA are summarized underneath each GvpA contains only a single substitution. Rf < 6 is regarded as weak interaction, whereas rf > 11 is similar to GvpA wild type. The Vac phenotype of the respective 㥊+Amut transformants is indicated by color: red, Vac negative green, cylinder shaped yellow, mini gas vesicles without color, wild type gas vesicles.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
Vol. 55, 2004

Absztrakt

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Olvass tovább

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
Vol. 55, 2004

Absztrakt

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Olvass tovább

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


Types of Vesicles

Different types of vesicles are found within the cell that has a wide variety of functions.

  • Vacuoles: These are tiny lipid enclosed structures that usually contain water, and are mostly seen in plants and certain baktériumok. They are used for regulating osmotic pressure in the cell.
  • Lizoszómák: Lysosomes are a type of vesicle which is involved in sejtes digestion. A lysosome contains proteolytic enzymes that can break down food molecules.
  • Peroxiszómák: Similar to lysosomes, peroxisomes are specialized vesicles that contain hydrogen peroxide. These vesicles are primarily involved in cellular oxidation reactions.
  • Transport vesicles: As the name suggests, these are tiny sacs enclosed by a lipid bilayer that is heavily involved in the transport of materials from and to the cell and between organelles.
  • Secretory vesicles: A type of specialized vesicle that carries substances out of the cell. They usually generate from the Golgi apparatus.
  • Synaptic vesicles: A type of specialized vesicle found in the types of neurons that store and transport neurotransmitter molecules.
  • Extracellular vesicles: Extracellular vesicles are found outside the cell and are used for transport into the cell. These type of vesicles are seen in both eukaryotic and prokaryotic cells.
  • Gas vesicles: These are found in bacteria and provide buoyancy to the cell.


The Gas Vesicle Gene Cluster from Microcystis aeruginosa and DNA Rearrangements That Lead to Loss of Cell Buoyancy

ÁBRA. 1 . Az gvp gene cluster region in M. aeruginosa and IS found in the GV-deficient mutants. (A) Strain PCC 7806 (B) strain PCC 9354. From top to bottom, names and sizes of the IS, localizations of the insertions, names of the putative genes, maps of the ORFs and their orientations, and intergenic regions (ig) in base pairs (bp) are shown. Arrows, ORFs black arrows and lines, sequenced regions grey-shaded arrows and lines, nonsequenced regions. Precise locations (with respect to the sequence submitted to DDBJ/EMBL/GenBank under no AJ577136) of the insertion elements are as follows: between nucleotides 115 and 2206 for ISMae1, between nucleotides 4033 and 4034 for ISMae2, between nucleotides 7633 and 7634 for ISMae3, and between nucleotides 8301 and 8302 for ISMae4. ÁBRA. 2. Transcription analysis of the gvp fürt. (A) RNA blot analysis of the gvpA, gvpC, és rnpB transcripts from M. aeruginosa PCC 7806 grown under a day-night cycle (16 h-8 h). The cells were harvested for RNA extraction after 1 h of light when the culture reached OD750 = 0.4. The same blot (15 μg of total RNA per lane) was successively hybridized with different probes: a 180-bp gvpA fragment (obtained by PCR amplification with primers 635 and 636), a 400-bp gvpC fragment (amplified with primers 870 and 871), and (as a control for RNA loading and transfer) a 0.6-kb rnpB fragment (obtained by PCR with the primers mentioned in Materials and Methods). The sizes of the different transcripts are indicated in kilobases (kb). (B) RT-PCR analysis showing cotranscription between the genes of the gvp fürt. Az gvpC-N fragment was amplified with primers 893 and 973, the gvpN-J fragment was amplified with primers 975 and 1108, the gvpJ-X fragment was amplified with primers 974 and 1110, the gvpX-K fragment was amplified with primers 978 and 1109, the gvpK-F fragment was amplified with primers 1111 and 1113, the gvpF-G fragment was amplified with primers 965 and 1018, and the gvpK-G fragment was amplified with primers 965 and 1111. s, analyzed sample (with cDNA as a template) −, negative control (with RNA as a template) +, positive control (with genomic DNA as a template). A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes M). ÁBRA. 3 . Detection of the IS by PCR analysis of the gvp region of the wild-type (WT) and the GV-deficient mutant (M1, M2, M3, and M4) strains of M. aeruginosa. Primers used for amplification (see Table 1) were as follows: primers 1006 and 1017 for the 5′ gvpAén-5′ gvpC region, primers 1081 and 1082 for gvpV, primers 949 and 972 for gvpN, and primers 983 and 1077 for gvpW. A 1-kb DNA ladder (Invitrogen Life Technologies) was used as a size marker (lanes M). ÁBRA. 4. Transcription analysis of gvp genes in the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. (A) RT-PCR with the gvpA-specific primers 994 and 995 (see Table 1). The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M2 and M3) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. (B) RT-PCR results for the three genes carrying an IS (gvpN, gvpV, és gvpW) and for gvpJ és gvpX. The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M3 and M2) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. Az gvpV gene was amplified with primers 1081 and 1082, gvpN was amplified with primers 949 and 972, gvpJ was amplified with primers 974 and 975, gvpX was amplified with primers 1109 and 1110, and gvpW was amplified with primers 983 and 1077. A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes M). ÁBRA. 5 . Immunodetection of GvpA on isolated GV and cell extracts from the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. GV, enriched GV fraction (20 μg) from PCC 7806 wild-type strain. Other lanes show the results for crude extracts (200 μg) from PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M1, M2, and M3) strains and from PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains. ÁBRA. 6 . Electron micrographs of the wild-type strains (A and E) and the GV-deficient mutant strains (B, C, D, and F) of M. aeruginosa. (A) PCC 7806 wild type (B) PCC 7806 M1 (C) PCC 7806 M2 (D) PCC 7806 M3 (E) PCC 9354 wild type (F) PCC 9354 M4. gv-l, GV in longitudinal section gv-c, GV in cross-section. Bars, 500 nm.

Segítő információ

S1 ábra sic1 mutant exhibits developmental defects in rosette leaves.

(A) The 3-week-old sic1 mutant grown on artificial soil shows growth retardation compared to Col-0. Scale bar represents 3 cm. (B) The rosette leaf number of Col-0 and sic1. Scale bar represents 2 cm. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Fig. The leaf developmental phenotype of sic1 is partially driven by root.

The images were taken on the 20th day after grafting. Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 gyökér sic1/Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted plants sic1, significant ionome changes 1.

S3 Fig. CTL1 is highly conserved among different species.

Protein sequence alignment of CTL1 among different species shows CTL1 is highly conserved and the mutation site of sic1 is located in a conserved domain. And the red boxes show the TMHs. The red triangle indicates the mutation site of sic1. CTL1, choline transporter-like 1 sic1, significant ionome changes 1 TMH, transmembrane helix.

S4 Fig. The expression of CTL1 ban ben sic1 és cher1-4.

(A) The insertion site of cher1-4 and the position of primers used in this experiment. The triangle showed the insertion site of cher1-4 and the arrows shows the positions of primers used in this experiment (B) RT-PCR analysis of CTL1 transcripts in Col-0, sic1, és cher1-4. UBC was used as an internal standard for the RT-PCR. Single PCR reactions were performed on RNA from individual plants of each genotype. (C) The qRT-PCR result of CTL1 in Col-0, sic1 és cher1-4. The data represent the means ± SE n = 3. The raw data can be found in S1 Data. Col-1, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 PCR, polymerase chain reaction qRT-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction RT-PCR, real-time polymerase chain reaction sic1, significant ionome changes 1.

S5 Fig. Genetic and transgenic complementation of developmental phenotype sic1.

(A) The 6-day-old seedlings of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines grown on agar-solidified 1/2 MS medium plate. Scale bar represents 1 cm. (B) Primary root length of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines. Letters above bars indicate statistically different groups using a one-way ANOVA, followed by an LSD test at the probability of p & lt 0,05. Data represent means ± SE, n = 10 for each genotype. (C) Root patterning of Col-0 and sic1_CO plants. Scale bars represent 50 μm. The raw data can be found in S1 Data. Col-0, Columbia-0 LSD, least significant difference sic1, significant ionome changes 1.

S6 Fig. The expression pattern of CTL1 in different tissues of A. thaliana.

(A-D) CTL1-GFP showed the expression pattern in root tip (A), root maturation zone (B and C), leaf pavement cells (D). Three independent transgenic lines were observed and showed the same expression pattern. Green channel represents CTL1-GFP signal and red channel represents propidium iodide signal. Scale bars represent 50 μm for (A) and (D). (E) The relative expression of CTL1 in the shoot and root of Col-0 plants. Data represent means ± SE, n = 3. The raw data can be found in S1 Data. CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein.

S7 Fig. CTL1 localizes to PM and endosome membrane vesicles.

(A) An enlarged view of CTL1-GFP in the root tip of Col-0 plant. Green channel shows the GFP signal and red channel shows the PI signal. Scale bar represents 10 μm. (B) Subcellular localization of CTL1-GFP after plasmolysis in Col-0 root. Green channel shows the GFP signal. Scale bar represents 50 μm. (C) CTL1 is co-localized with FM4-64 in root cells. Green channel shows the CTL1-GFP signal red channel shows the FM4-64 signal. The insets showed an enlarged view of epidermal cell. Scale bars represent 5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide PM, plasma membrane.

S8 Fig. The aggregation of NRAMP1 and PDCB proteins locate in different intracellular organelles.

(A) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP is co-localized with FM4-64 signal in sic1. (B and C) The intracellular aggregations of PDCB1-GFP (B) and PDCB2-GFP (C) are not co-localized with FM4-64 in sic1. The transgenic seedlings of sic1 background were stained with FM4-64 for 1 h and then observed in confocal microscope. Green channels represent the GFP signal, and red channels represent the FM4-64 signal. The scale bars represent 7.5 μm in (A) and 5 μm in (B and C). (D) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP in sic1 localized to TGN. The scale bars represent 7.5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide NRAMP1, natural resistance-associated macrophage protein 1 PDCB, plasmodesmata callose-binding protein sic1, significant ionome changes 1.

S9 Fig. The expression pattern of HMA4 in the roots of Col-0 and sic1.

The insets showed an enlarged view of sic1 root hair. Scale bars represent 50 μm. Col-0, Columbia-0 HMA4, heavy metal ATPase 4 sic1, significant ionome changes 1.

S10 Fig. The expression of iron uptake related genes in the roots of Col-0 and sic1.

(A-B) The expression levels of IRT1 (A) and AHA2 (B) in the roots of Col-0 and sic1. The data represent the mean ± SE, n = 3. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (p < 0.01) calculated using Student t teszt. The raw data can be found in S1 Data. AHA2, Arabidopsis H + -ATPase 2 Col-0, Columbia-0 IRT1, iron regulated transporter 1 sic1, significant ionome changes 1.

S11 Fig. The recycling of PIN1 was affected in sic1 mutáns.

(A) The BFA compartments were observed after CHX and BFA treatment in Col-0 and sic1. (B) The subcellular localization of PIN1 in Col-0 and sic1 after BFA washout. Scale bars represent 20 μm. (C) The statistics analysis of percentage of cells with BFA bodies. The data represent the mean ± SE, ten seedlings of three independent transgenic lines were used in this analysis. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (p < 0.01) calculated using Student t teszt. The raw data can be found in S1 Data. BFA, brefeldin A CHX, cycloheximide Col-0, Columbia-0 PIN1, PIN formed 1 sic1, significant ionome changes 1.

S1 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in artificial soil.

Data represents means ± SE, p-values were calculated by Student t teszt, n = 12. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, p-values were calculated by Student t teszt, n = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S3 Table. Root ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, p-values were calculated by Student t teszt, n = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S4 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 reciprocal grafting experiment.

Data represents means ± SE. sic1 /Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 root. n = 7–19. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted Col-0 sic1, significant ionome changes 1.

S5 Table. Leaf ionome of genetic complementation.

Data represents means ± S.E., n = 12 for each genotype.

S6 Table. Leaf ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ± SE, sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wild-type pSIC1::SIC1-GFP, n = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S7 Table. Root ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ±S.E., sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wildtype pSIC1::SIC1-GFP, n = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S8 Table. Primers used in this study (from 5ʹ–3ʹ).

S1 adatok. Data used to generate the figures.


Nézd meg a videót: Szóbeli érettségi a Bibó Gimnáziumban (Január 2022).