Információ

Mennyire használják a fáziskontraszt és a sötétmezős mikroszkópot a biológiai kutatásokban?


Mennyire alkalmazzák ma a biológiai kutatásokban a fáziskontraszt és a sötétmezős mikroszkópot? Úgy tűnik, ezeket nagyon régen találták ki, ezért arra gondolok, jó ötlet lenne megtanulni ezeket a technikákat. (Jövő tavasszal indítok egy biológia alapképzést… de továbbra is leginkább az érdekel, hogy a kutatók mennyire használják ezeket a technológiákat: ha keveset, akkor jobban kihasználom az időmet)


Nagyon gyakran használok fáziskontrasztot, mivel csak egy objektívcsoport váltásáról van szó világos mezőről. Ahelyett, hogy órákat töltenék a festéssel, vagy ami még rosszabb, az immunfestéssel, néhány másodperc alatt megkapom az összképet (sejtátmérő). Még másnap is visszamehetek ugyanabba a cellába. A sötét mezőre váltás a tárcsa elforgatásával vagy egy kapcsoló megnyomásával is jár.

Ha már használod a brightfield-et, akkor a ténylegesen hasznos fizika, vagy a minta-előkészítés szempontjából nem nagyon kell róluk tanulni. Azokra a dolgokra, amelyeket meg lehet tanulni – mondjuk, hogy a színeket a sötét mezőben megváltoztatják – ritkán lesz szükség a gyakorlatban. Ezek a módszerek olyan dolgok, amelyeket nem igazán kell mélyrehatóan tudnod, hacsak a kísérleteid nem követelik meg őket. A gyakorlat és a könyökzsír még akkor is hasznosabb lenne, mint a fejlett optika. Ne feledje, hogy a legtöbb esetben a tudományos hipotézis fontosabb, mint a megoldáshoz használható eszközök.


Ha bármilyen sejtbiológiai munkát tervez (és ha biológiára készül, akkor szinte biztos, hogy valamikor meg fog tenni), a mikroszkóp használatának megtanulása elengedhetetlen. A sejtek növesztése során gyakran használ egy szkópot a morfológiájuk elemzésére, megszámlálására, a szennyeződés jeleinek keresésére, a differenciálódás vizualizálására stb. A mikroszkópokat immunfluoreszcenciás és immunhisztokémiai festési protokollok végrehajtásakor is használják.

Tehát bár a hangszerek és egyes technikák már jó ideje léteznek, ma is nagyon aktuálisak.


38 - FÁZISKONTRASZT MIKROSZKÓPIA HASZNÁLATA

A fáziskontraszt mikroszkópia nagyon hasznos és hatékony eszköz a mononukleáris fagociták morfológiájának vizsgálatára. A fénymikroszkópiában a mintán áthaladó fényben a két fontos változás az amplitúdó vagy a fázis változása. Hagyományos fényerejű megvilágítás esetén a festett minták tárgyon belüli kontrasztjával végzett mikroszkópos vizsgálatot főként a fényelnyelés különbségei okozzák. A fázismikroszkópos megvilágításhoz olyan fényforrásra van szükség, amely egy viszonylag keskeny vonal a színpad alatti kondenzátor hátsó fókuszsíkjában. A kondenzátor és az objektív megfelelően fókuszált fényhullámok, amelyek a gyűrű alakú forrás egy pontjáról indulnak, párhuzamos sugárköteget alkotnak, amikor áthaladnak a térsíkon. A fáziskontraszt mikroszkópos vizsgálat során a mintából kilépő közvetlen és szórt fény fázisváltozása teszi láthatóvá a tárgyat. A törésmutató vagy a fényút hosszának változása elsősorban a mintán belüli éleknél fordul elő, így a fázisjelenség éleffektussá válik.


Mennyire használják a fáziskontraszt és a sötétmezős mikroszkópot a biológiai kutatásokban? - Biológia

Charlotte K. Omoto*
*Genetikai és Sejtbiológiai Tanszék

Joan Folwell#
#Állattani Tanszék

Washingtoni Állami Egyetem
P. O. 644234-es doboz
Pullman, WA 99164-4234
Hang: (509) 335-5591
Fax: (509) 335-1907

BEVEZETÉS

A fénymikroszkópia a biológia fontos vizsgálati eszköze, amelyet rendszeresen használnak a középiskolákban és főiskolákon. Sok biológiai minta szerkezete alacsony kontrasztú, amit nem lehet feltárni a sok osztályteremben rendelkezésre álló fényes terű összetett mikroszkóppal. Azok a mikroszkópok, amelyek speciális optikával javítják ezeknek a mintáknak a kontrasztját, a legtöbb oktatási költségkerethez képest megfizethetetlenül drágák. Ez a cikk egy egyszerű, olcsó módosítást ír le, amely a világosterű mikroszkópot sötétterű mikroszkóppá változtatja, lehetővé téve az alacsony kontrasztú minták vizsgálatát. Ez a cikk a sötétmezős mikroszkópia alapelméletét ismerteti. Fényképek kerülnek bemutatásra, amelyek összehasonlítják a világos és sötét mezős alkalmazásokat. Ez a technika lehetővé teszi a fényerejű mikroszkóp kiterjesztett használatát a tanítás minden szintjén, nagyon csekély manipuláció és költség nélkül.

A sötéttér-mikroszkópia elmélete

A mikroszkópokat tárgyak nagyítására használják. A nagyítás révén a kép nagyobbnak tűnik, mint az eredeti tárgy. Egy tárgy nagyítása nagyjából úgy számítható ki, hogy az objektívlencse nagyítását megszorozzuk a szemlencse nagyításával. Az objektumok nagyításra kerülnek, hogy az apró részletek is láthatóak legyenek. Az elérhető nagyításnak nincs korlátja, van azonban olyan nagyítás, amelyen túl a részletek nem válnak tisztábbá. Az eredményt üres nagyításnak nevezzük, amikor a tárgyakat megnagyobbítjuk, de részleteik nem válnak tisztábbá. Ezért nem csak a nagyítás, hanem a felbontás is fontos a képen lévő információ minősége szempontjából.

A mikroszkóp felbontóképességét úgy határozzuk meg, mint két egymástól távol lévő pontot. A mikroszkóp felbontása számos tényezőtől függ a felépítésében. A látható fény hullámhossza (400-600 nm) a felbontásnak is van egy elméleti korlátja. A felbontás elméleti határa (a legkisebb távolság, amely két pont között látható) a következőképpen számítható ki:

ahol l a használt fény hullámhosszát jelenti, N.A. pedig a numerikus apertúrát. A diák-minőségű mikroszkópok felbontása általában az elméleti határnál jóval alacsonyabb a gyengébb minőségű lencsék és megvilágítási rendszerek miatt.

A szabványos fénymezős mikroszkópia azon alapul, hogy a lámpaforrásból származó fényt a színpad alatti kondenzátor összegyűjti, és kúppal formálja, amelynek csúcsa a minta síkjára fókuszál. A példányokat azért látják, mert képesek megváltoztatni a rajtuk áthaladó fény sebességét és útját. Ez a képesség a minta törésmutatójától és átlátszatlanságától függ. Ahhoz, hogy egy mintát fényes terű mikroszkópban lássunk, a rajta áthaladó fénysugarakat annyira meg kell változtatni, hogy interferálhassanak egymással, ami kontrasztot (a fényintenzitásbeli különbségeket) hoz létre, és ezáltal képet alkot. Ha a minta törésmutatója túlságosan hasonló a környező közegéhez a mikroszkóp tárgyasztala és az objektívlencse között, akkor nem látható. A biológiai anyagok jó megjelenítéséhez az anyagoknak rendelkezniük kell ezzel az eredendő kontraszttal, amelyet a megfelelő törésmutató okoz, vagy mesterségesen festettnek kell lenniük. Ezek a korlátozások megkövetelik az oktatóktól, hogy találjanak természetesen magas kontrasztú anyagokat, vagy fokozzák a kontrasztot festéssel, ami gyakran megöli őket. Az átlátszó élő anyagok vagy vékony, nem festett minták megfelelő megjelenítése világosterű mikroszkóppal nem lehetséges.

A Darkfield mikroszkóp más megvilágítási rendszeren alapul. Ahelyett, hogy a mintát egy töltött fénykúppal világítanák meg, a kondenzátort úgy tervezték, hogy üreges fénykúpot képezzen. A kúp csúcsán lévő fény a minta síkjára fókuszál, ahogy ez a fény a minta síkján túlhaladva ismét üreges kúpmá terjed. Az objektívlencse ennek a kúpnak a sötét üregében helyezkedik el, bár a fény az objektívlencse körül és mellett halad, nem jut be sugárzás (1. ábra). A teljes mező sötétnek tűnik, ha nincs minta a mikroszkóp tárgyasztalán, így a sötétterű mikroszkóp elnevezés. Amikor egy minta a színpadon van, a kúp csúcsán lévő fény rácsap. A képet csak a minta által szétszórt és az objektívlencsébe rögzített sugarak készítik (figyelje meg a minta által szórt sugarakat az 1. ábrán). A kép világosnak tűnik a sötét háttér előtt. Ez a helyzet a porszemcsék csillogó megjelenéséhez hasonlítható egy sötét szobában, amelyet az oldalsó ablakon keresztül beáramló erős fénytengelyek világítanak meg. A porrészecskék nagyon kicsik, de könnyen észrevehetők, amikor szórják a fénysugarakat. Ez a sötéttér-mikroszkópia működési elve, és elmagyarázza, hogyan jön létre az alacsony kontrasztú anyagok képe: egy tárgy akkor lesz látható sötét háttér előtt, ha szórja a fényt, amelyet a megfelelő eszközzel, például objektívvel rögzítenek.

A legjobb minőségű sötétterű mikroszkópok speciális költséges kondenzátorokkal vannak felszerelve, amelyeket csak sötétmezős alkalmazásokhoz gyártottak. Ez a sötétmező-effektus világosmezős mikroszkópban elérhető, azonban egy egyszerű "stop" hozzáadásával. Az ütköző a színpad alatti kondenzátor alatt elhelyezett átlátszatlan anyagdarab, amely blokkolja a mikroszkóp alapjából érkező fénysugár középpontját, és kialakítja a sötéttér megvilágításához szükséges üreges fénykúpot.

Eljárások

    Carl Zeiss USA
    Mikroszkópos osztály
    1-800-233-2343
    (kérje a helyi képviselő nevét és számát)

Ha a mikroszkópokhoz nem áll rendelkezésre gyártott darkfield stop, akkor van néhány alternatíva. Ha van egy szűrőtartó a kondenzátor alatt, akkor egy másik cégtől származó sötét mezős ütköző is beleférhet vagy alkalmassá tehető. Egy érme vagy más átlátszatlan anyagból készült kör felszerelhető egy átlátszó korong, például üveg közepére, és behelyezhető. Az ütköző úgy is kialakítható, hogy fekete építőpapírból kilyukaszt egy kört, amelyet dupla ragasztószalaggal rögzítenek a kondenzátor aljára. Ez az alternatíva kissé trükkös lehet, mert az anyagot a kondenzátor közepére kell helyezni, és a szalag eltávolításakor a kondenzátort meg kell tisztítani. Technikailag a sugár megfelelő blokkolása érdekében az ütköző átmérőjének 8 mm és 20 mm között kell változnia az objektívlencse nagyításától és numerikus rekeszértékétől függően.

A Darkfield mikroszkóp kétféle módon csökkenti a mikroszkóp lencserendszerébe jutó fény mennyiségét. Először is, az ütköző blokkolja a fénysugár középpontját, amely egyébként kitöltené az objektívlencsét. Másodszor, csak az a fény látható, amelyet a minta szór, és belép az objektívlencsébe. Ezért a legjobb megtekintési eredmény a fényintenzitás lehető legnagyobb mértékű növelését igényli: a fényintenzitás-beállítás maximumra állításával, a terepi membrán kinyitásával, a kondenzátor rekesznyílásának kinyitásával, valamint a szín- és egyéb szűrők eltávolításával. A megfelelő mikroszkóp tárgylemezeket is kell használni, ezek 1 mm vastagok.

A legjobb kép elérése érdekében a megvilágítást be kell állítani és be kell állítani. A sötéttér módosítása előtt igazítsa a fénysugarat a látómező közepére a gyártó utasításai szerint. Az alsó kondenzátor és az objektívlencse fókuszálásának megkönnyítése érdekében használjon olyan tárgylemezt, amely tele van olyan mintákkal, amelyeken könnyen megtalálható utasítások a pofasejt tárgylemezének elkészítéséhez. Fókuszáljon a mintalemezre alacsony nagyítással (10X) világosmező módban. Helyezze be a sötétmező ütközőt a fókusz megváltoztatása nélkül. Győződjön meg arról, hogy a maximális fénymennyiség áll rendelkezésre. Állítsa fel a kondenzátort a legmagasabb pozícióba a kondenzátor fókusz gombjával. Nézze meg a mintát, és lassan engedje le a kondenzátort, amíg a minta sötét háttér előtt és a legélesebb kontrasztban nem látható. Végül állítsa be a kép nézetét a finomfókusz gombbal.

A sötétterű mikroszkópia korlátai

A sötétterű mikroszkópia előnye egyben a hátránya is: nemcsak a minta, hanem a por és egyéb részecskék is szórják a fényt, és könnyen megfigyelhetők. Például nemcsak az arcsejtek, hanem a nyálban lévő baktériumok is jól láthatóak a 2D. ábrán. Sötétmezős alkalmazás esetén nagyobb gondossággal kell eljárni a minta előkészítésében. Az üveglemezeket alaposan meg kell tisztítani az idegen portól és szennyeződésektől. Szükséges lehet a mintaközeg (agar, víz, sóoldat) szűrésére, hogy kizárjuk a zavaró szennyeződéseket. A mintaanyagokat vékonyan kell szétszórni. Túl sok anyag a tárgylemezen sok átfedő réteget és élt hoz létre, ami megnehezíti a struktúrák értelmezését.

A kép létrehozásához ez a technika a minták szórt fényére támaszkodik. A szín hiánya vagy minimális, ami csalódást okozhat a néző számára. A minták tényleges méretét is befolyásolja, az objektumok szélessége eltúlzódik.

Példák sötétmezős képekre.

A 2. ábra az élő Chlamydomonas, egy biflagellate algák képeit hasonlítja össze világos és sötét mezőben. Bár a sejtek fényes mezővel láthatók, a flagellák nem észlelhetők (2B. ábra). Némi kontraszt érhető el a kondenzátor nyílás membránjának bezárásával, amely lehetővé teszi a flagellák láthatóságát (2A. ábra). A kondenzátor rekesznyílásának bezárása azonban csökkenti az objektív numerikus rekeszértékét, ami hatékonyan csökkenti a felbontást. A Darkfield lehetővé teszi, hogy a flagellák és a belsejében lévő részletek jól láthatóak legyenek (2C. ábra). A sötétterű mikroszkóp használata így nagy kontrasztot és nagy felbontást is biztosít.

Az arcsejtek gyors vizsgálatot végeznek. A szájüregi sejteket úgy nyerjük, hogy a száj belsejét fogpiszkálóval finoman kaparjuk, majd a sejteket egy tárgylemezen vékonyan szétterítjük, a készítményre fedőlapot helyezünk, amelyet nem hagyunk megszáradni. Ezeknek a sejteknek nincs eredendő kontrasztjuk, és nehezen láthatók világos mezővel. Drámai kontrasztot érünk el egy sötétmezős mikroszkópban, a sejtmag és más intracelluláris zárványok, valamint a környező közegben lévő baktériumok könnyen lokalizálhatók és azonosíthatók (2D. ábra).


A fáziskontrasztmikroszkópia működési elve

A fáziskontraszt mikroszkópia azon az elven alapul, hogy a fénysugarak kis fázisváltozásai, amelyeket egy tárgy különböző részeinek vastagságában és törésmutatójában mutatkozó különbségek okoznak, a fényerő vagy a fényintenzitás különbségeivé alakíthatók át.

Egyszerűen fogalmazva, a fáziskontraszt mikroszkópia a fordítása láthatatlan fáziseltolódások -ba látható intenzitásbeli különbségek. A fázisváltozások az emberi szem számára nem észlelhetők, míg a fényerő vagy a fény intenzitása az emberi szem számára könnyen észlelhető.

A fáziskontraszt mikroszkóp optikai alkatrészei

A fáziskontraszt mikroszkóp optikai összetételében hasonló egy közönséges összetett mikroszkóphoz. A normál mikroszkóphoz hasonlóan fényforrással, kondenzátorrendszerrel, objektívlencse-rendszerrel és szemlencse-rendszerrel rendelkezik.

A fáziskontraszt mikroszkóp abban különbözik a normál mikroszkóptól KETTŐ további komponensek:

(1). Alfázisú gyűrűs membrán

(2). Fázislemez

(1). Alfázisú gyűrűs membrán

A mikroszkóp alsó kondenzátora alatt található. Az alfokozatú gyűrű alakú membrán segít létrehozni a keskeny, üreges kúp vagy fénygyűrű hogy megvilágítsa a tárgyat.

(2). Fázislemez

A fázislemezt diffrakciós lemeznek vagy fáziskésleltető lemeznek is nevezik. Az objektívlencse hátsó fókuszsíkjában található. A fáziskésleltető komponensek ezen a lemezen vannak bevonva. A fázislemez egy átlátszó üvegkorong egy vagy néhány csatornával. A csatorna olyan anyaggal van bevonva, amely képes elnyelni a fényt, de nem késlelteti azt. A fázislemez másik része (a csatornán kívül) fénykésleltető anyagokkal van bevonva, például magnézium-fluoriddal. A fázislemez segít csökkenteni a beeső fény fázisát.

Hogyan jön létre a kontraszt a fáziskontrasztmikroszkópiában?

A festetlen sejtek normál mikroszkóp alatt nem tudnak kontrasztot létrehozni. Amikor azonban a fények áthaladnak egy festetlen cellán, különböző törésmutatójú és vastagságú régiókkal találkoznak a cellákban. Amikor a fénysugarak nagy törésmutatójú területen haladnak át, az eltér a normál útjától, és az ilyen fénysugár fázisváltozást vagy fáziskésleltetést tapasztal. A kisebb törésmutatójú területen áthaladó fénysugarak változatlanok maradnak (nincs fázisváltozás).

A retardált és nem retardált fénysugarak fáziskülönbsége kb ¼ eredeti hullámhosszúságú (pl. λ/4). Az emberi szemek NEM képes érzékelni a fény fázisának ezt a kis változását, és így az ilyen kis fázisváltozások nem hoznak létre kontrasztot a képen. A fáziskontraszt mikroszkóp speciális eszközökkel (gyűrű alakú membrán és fázislemez) rendelkezik, amelyek ezeket a parányi fázisváltozásokat amplitúdó- vagy fényerő-változásokká alakítják át, így a végső képen kontrasztkülönbség jöhet létre. Ez a kontrasztkülönbség a szemünkkel könnyen észlelhető.

Nézzük meg, hogyan ér el a fáziskontraszt mikroszkóp kontrasztot a képen anélkül, hogy a tárgy elszíneződne. A fáziskontraszt mikroszkópban a kontraszt eléréséhez a diffrakciós hullámokat el kell választani a közvetlen hullámoktól. Ezt az elválasztást az alsó gyűrű alakú membrán biztosítja.

A gyűrű alakú membrán üreges fénykúppal világítja meg a mintát. Egyes sugarak (közvetlen sugarak) áthaladnak a minta vékonyabb részén, és nem esnek át semmilyen késleltetésen, és közvetlenül behatolnak az objektívlencsékbe. A minta sűrűbb tartományán áthaladó fénysugarakat figyelembe veszik, és azok késleltetett fázissal futnak, mint az el nem tért sugarak. A fény fázisának késleltetése kb ¼ a λ a beeső fénytől. Mind a retardált, mind a nem retardált fénynek át kell haladnia az objektív hátsó fókuszsíkján lévő fázislemezen, hogy a végső kép létrejöjjön.

A fázislemezt úgy tervezték és helyezték el, hogy a késleltetett fénysugarak áthaladjanak a fázislemez azon a területén, ahol fénykésleltető anyagok vannak bevonva. Amikor az ¼ (vagy λ/4) késleltetett fényt vezetnek át a fázislemez ezen tartományán, tovább késleltetik ¼-rel (vagy λ/4-gyel). Ezzel a végső változás vagy retardáció az lesz, ¼λ + ¼λ = ½λ (vagy λ/4 + λ/4 = λ/2). A nem késleltetett sugarak áthaladnak a fázislemez csatornáin, és fázisukat a fázislemez nem változtatja meg.

Amikor a retardálatlan és ½λ (vagy λ/2) retardált fényt rekombinálnak (a fókuszpontban), a negatív vagy destruktív interferencia jön létre, mert a címer és keresztül a retardált és retardált fénysugarak kioltják egymást. A destruktív interferencia hatására a minta képe sötétebbnek tűnik világos háttér előtt. Másrészt, ha az el nem térő fénysugarak áthaladnak az anyagra vonatkozó fázison, akkor a két sugár ugyanabban a fázisban lesz, és az eredmény egy pozitív vagy konstruktív interferencia. Konstruktív interferencia esetén a minta képe világosabbá válik sötét háttér előtt. Így a fáziskontraszt mikroszkópiában a destruktív és építő interferencia kombinációja nagy kontrasztot hoz létre a végső képen.

A fáziskontrasztmikroszkópia alkalmazásai

A nagyítási és felbontású fáziskontraszt mikroszkóp hasonló a közönséges mikroszkópéhoz. Ennek ellenére a PCM-nek számos alkalmazása van a biológiai tudományokban. A fáziskontraszt mikroszkópia alkalmazásai a következőképpen foglalhatók össze:

Ø A PCM lehetővé teszi az élő sejtek megjelenítését.

Ø Lehetővé teszi a festetlen sejtek megjelenítését.

Ø A PCM segítségével különféle sejtszervecskék (mitokondriumok, sejtmagok és vakuólumok) megtekinthetők.

Ø Segít tanulmányozni a sejtes eseményeket, például sejtosztódást, fagocitózist, ciklózist stb.

Ø Mindenféle sejtmozgás, például kromoszómális és flagelláris mozgások megjelenítésére szolgál.

Ø Lehetővé teszi a citoszkeleton dinamikájának tanulmányozását sejtosztódás, fagocitózis stb.

Ø Lehetővé teszi a sejtek és a különböző organellumok membránpermeabilitásának tanulmányozását.

Ø A fáziskontraszt mikroszkópiát széles körben használják élő sejtek megfigyelésére szövettenyészetben, növekedésük nyomon követésére

A fáziskontraszt mikroszkóp előnyei

Ø Tiszta képet biztosít a festetlen sejtekről.

Ø Kerülje el a sejtek kémiai előkészítés és festés miatti károsodását.

Ø Nagy kontrasztú képeket biztosít, kiemelve a cellák finom részleteit.

Ø Az optikai felépítés viszonylag egyszerű.

Ø Egy összetett mikroszkóp kisebb kiegészítésekkel fáziskontraszt mikroszkóppá emelhető.

Ø Lehetővé teszi az élő sejtek hosszú távú megfigyelését anélkül, hogy elveszítené a sejtek életképességét.

Ø Élő sejtes képalkotás és élő folyamatfigyelés lehetséges.

A fáziskontraszt mikroszkóp hátrányai / korlátai

Ø A fáziskontraszt mikroszkóp fényes fényudvart hoz létre a képek körül. A halo képződése a közvetlen és az eltért sugarak részleges vagy nem teljes szétválásából adódik.

Ø A PCM csak az egyes cellák vagy vékony cellarétegek megtekintéséhez használható.

Akár ez is tetszhet…

További előadásjegyzetek az Easy Biology osztályból…

Böngésszen tovább az Easy Biology Class…-ban

Ha tetszett ez a poszt, kérlek KOMMENTES. . . . (alatt ↓)


Az összetett mikroszkóp működési elve

Az összetett mikroszkópok azon az elven működnek, hogy amikor egy kis nagyítandó mintát közvetlenül az objektív lencséjének fókuszán túlra helyeznek, virtuális, fordított és nagymértékben felnagyított képe keletkezik a tárgyról a szemtől a legkülönbözőbb látástávolságban. közel tartva az okulárhoz.

Összetett mikroszkóp osztályozása

Az összetett mikroszkóp két kategóriába sorolható

1. Fénymikroszkóp

A fénymikroszkóp további négy kategóriába sorolható, mint pl

  1. Fényes mezős mikroszkóp
  2. Sötétmezős mikroszkóp.
  3. Fáziskontraszt mikroszkóp.
  4. Fluoreszcens mikroszkóp.

2. Elektronmikroszkóp

Az elektronmikroszkóp további három kategóriába sorolható, mint pl

1. Fénymikroszkóp

A fénymikroszkópok látható fényt és nagyító lencséket használnak a szabad szemmel nem látható kis tárgyak vagy a szabad szem által megengedhetőnél finomabb részletek vizsgálatára. A mikroszkópiában azonban nem a nagyítás a legfontosabb kérdés.

Ezek a következő csoportokba sorolhatók

a. Világos mezős mikroszkóp

Világos terű mikroszkópban a minta sötétnek tűnik a világos háttér előtt.

Alkalmazások:

Laboratóriumban használják a mikroorganizmusok külső szerkezetének tanulmányozására.

b. Sötétmezős mikroszkóp:

A sötétterű mikroszkópban a minta fényesnek tűnik a sötét háttér előtt.

Alkalmazások:

Ez a mikroszkóp a festetlen, vékony élő sejtek megkülönböztetésére szolgál, amelyek egyszerű mikroszkóp alatt nem láthatók.

c. Fáziskontraszt mikroszkóp:

Néhány pigmentálatlan élő sejt nem látható a fénymikroszkópban, mert nem tud kontrasztot létrehozni a sejtek és a víz között. Csak a fáziskontraszt mikroszkóp képes kontraszt különbséget létrehozni a sejt és a víz között, ezért ezek a sejtek csak a fáziskontraszt mikroszkópban láthatók

Alkalmazás:

Használata mikroorganizmusok alakjának és mozgékonyságának tanulmányozására.

d .Fluoreszcens mikroszkóp:

Ennél a típusnál a mintát fluoreszcens festékekkel festik meg, majd ultraibolya sugárzásnak (UV) teszik ki. A fluoreszkáló festékek elnyelik az alacsony hullámhosszú fényt, és izgatottak lesznek, aminek eredményeként nagy hullámhosszú fényt bocsátanak ki. Ezzel a mechanizmussal működnek a fluoreszcens mikroszkópok.

Alkalmazás:

Használata orvosi laboratóriumokban kórokozók azonosítására. Különleges fehérjék lokalizálására is használják.

2. Elektronmikroszkóp

Az elektronmikroszkópok elektronokat használnak megvilágítási forrásként. Nagyobb felbontóképességgel rendelkezik, mint a fénymikroszkópoké.

Különféle típusú elektronmikroszkópok léteznek, mint pl

a. Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM)

Az ilyen típusú elektronmikroszkóp a minta képét úgy állítja elő, hogy a felületet egy fókuszált elektronsugárral pásztázza. Az elektronok kölcsönhatásba lépnek a mintában lévő atomokkal, különböző jeleket hozva létre, amelyek információkat tartalmaznak a minta felszíni topográfiájáról és összetételéről.

Alkalmazás:

A mikroorganizmusok felületének részletes tanulmányozására szolgál.

b. Transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM)

Ebben a mikroszkópban az elektronsugarat egy próbatesten vezetik át, hogy kép alakuljon ki. A TEM-hez használt minta vastagsága 20–100 nm legyen.

Alkalmazás:

Egy példány belső szerkezetének tanulmányozására használt.

c. Konfokális mikroszkópia

Konfokális mikroszkóp, más néven konfokális lézer pásztázó mikroszkóp (CLSM) vagy lézeres konfokális pásztázó mikroszkóp (LCSM).

Ez egy optikai képalkotási technika a mikrofelvétel optikai felbontásának és kontrasztjának növelésére térbeli tűlyuk használatával, amely blokkolja a képalkotás során a nem éles fényt.

Ez a mikroszkóp Több kétdimenziós kép rögzítése egy minta különböző mélységeiben lehetővé teszi a háromdimenziós struktúrák rekonstrukcióját (ez az eljárás optikai metszetként ismert) egy objektumon belül.

Alkalmazás

A konfokális mikroszkópiát széles körben használják a tudományos és ipari közösségekben, és tipikus alkalmazások az élettudományokban, a félvezető-vizsgálatban és az anyagtudományban.


Mikroszkóp – Tartalomjegyzék

A mikroszkóp definíciója

Két görög szóból származik, azaz a mikros jelentése kicsi, és a skopeo jelentése: nézni vagy nézni. A tudománynak azt az ágát, amely a mikroszkópok használatával foglalkozik különböző szabad szemmel láthatatlan sejtek és szövetek megtekintésére, mikroszkópiának nevezik.

A mikroszkópia története

A mikroszkóppal kapcsolatos terminológiák

1. Nagyítás: Ez a tárgy megnagyobbításának mértéke, ha mikroszkópból nézzük.
2. Felbontás: Úgy definiálható, mint két különálló entitásként megkülönböztethető pont közötti legrövidebb távolság. Minél kisebb az érték, annál nagyobb a mikroszkóp felbontása, és a képek részletei annál jobban láthatók.
3. Mikrográfia: A mikroszkóppal történő fényképezés területét ún mikrográfia.

Képlet a mikroszkóp felbontási teljesítményének kiszámításához

A lencse felbontóképessége a következő képlettel számítható ki:

(varepszilon = 0,61 imes frac<<< m>< m<.A>>< m<.>>>>) (Reyleigh-képlet)
(lambda :)Hullámhossz
(< m>< m<.55mu m>>) látható fényre használatos
N.A.: Objektív lencse N.A.

Fény- vagy optikai mikroszkópia

Amikor a mikroszkópban a mező megvilágítására használt fényforrás az fehér fény (látható fény), ez az úgynevezett fénymikroszkópia. A fehér fényt átengedik vagy visszaverik a biológiai mintán, majd a bejövő fény egy vagy több lencsén keresztül jut el a megfigyelőhöz. A fénymikroszkópban főként kétféle mikroszkópot használnak, azaz egyszerű mikroszkópot és összetett mikroszkópot.

Egyszerű mikroszkóp

Meghatározás: Az egyszerű mikroszkópok egylencsés mikroszkópok, amelyeket néha boncoló mikroszkópoknak is neveznek.

  1. Használt objektív: Nagyítója van, dupla domború lencsével, rövid gyújtótávolsággal.
  2. Elv: Egy egyszerű mikroszkóp azon az elven működik, hogy ha egy apró tárgyat egy domború lencse gyújtótávolságába helyezünk, az virtuális, egyenes és nagyított képet ad.
  3. Nagyítás: A lencse nagyítása a fókusztávolságától függ, és általában kisebb, mint az összetett mikroszkópé.

Az egyszerű vagy boncoló mikroszkóp diagramja

Összetett mikroszkóp

Meghatározás: Az összetett mikroszkópok kétlencsés mikroszkópok. A két lencsét objektívlencsének és okulárnak nevezik. Általában diákmikroszkópnak nevezik.

  1. Használt objektív: Az összetett mikroszkóp két konvex lencsét használ, az egyiket a szemlencsében, a másikat az objektívben. A szemlencse lencséi a gyújtótávolságtól függően változnak, így a nagyítások is különböznek. A tanulómikroszkóp három objektívlencsét tartalmaz, amelyek nagyítóereje (< m<10 x, 40 x>>) és (< m<100x>>), míg a szemlencse nagyítóereje (< m<5x, 10x, 15x, 20x>>) és (< m<30x>>)
  2. Elv: Az objektívlencse a mintáról szórt fényt kapja, míg a szemlencse a kép végső megfigyelésére szolgál. virtuális, álló és nagyított képet ad.
  3. Nagyítás: A lencse nagyítása a fókusztávolságától függ, és általában nagyobb, mint az egyszerű mikroszkópé.

Az összetett vagy diák mikroszkóp diagramja

Az összetett mikroszkóp részei

Egy tipikus összetett mikroszkóp a következő részekből áll:

  • 1. Fej/test: Ez a mikroszkóp felső része. A mikroszkóp teste a következő részeket tartalmazza:
    • a) Okulár: Szemlencsének is nevezik. Ez a fémcső felső végén található lencse. A monokuláris modellek egyetlen csővel rendelkeznek, míg a binokuláris modellek két csővel rendelkeznek, mindegyik egy-egy okulárral. A két cső közötti távolság a távolságnak megfelelően állítható
    • b) Okulárcső: Ez egy fémcső, (160,< m>) ((6,3) hüvelyk) hosszú. Ez a hosszúság az emberi szem felbontásán alapul, és az aberrációk minimalizálására tervezték.
    • c) Objektív lencse: Ezek a mikroszkóp elsődleges lencséi.
    • d) Orrrész: tartja az objektívlencséket, forgó mozgással rendelkezik, így kiválasztható egy adott objektív a mintával szemben.
    • d) Durva és finom fókuszállító gombok: A testcső mozgatására szolgálnak a kép fókuszálása érdekében. A durva gombok a kép durva fókuszálására szolgálnak, míg a finomfókusz gombok az elmosódott fókusz eltávolítására szolgálnak, és teljes mértékben a szem felbontási teljesítményén alapulnak.
    • e) szakasz: Ez egy lapos platform, amelyre egy minta van felszerelve. Ez egy mechanikus színpad, és enyhe mozgások is lehetségesek a jobb megvilágítás érdekében.
    • (f) Színpadi klipek: Tartsa szilárdan a tárgylemezt a helyén, és az ujjmozdulatokkal megtekintheti a minta különböző területeit.
    • g) Rekesznyílás: Ez az a lyuk, amelyen keresztül az áteresztett fény eléri a színpadot, majd a mintát.
    • h) Írisz rekeszizom: Szabályozza a mintát érő fény mennyiségét. Erre azért van szükség, mert a különböző minták eltérő mennyiségű fényt igényelnek az éles kontraszt és a jobb felbontás érdekében. Így az írisz diafragma a fény mennyiségének szabályozásával segít jobb kontraszt elérésében.
    • i) Kondenzátor: A membrán alatt található, és felfelé és lefelé mozgatható, hogy a fényt a mintára fókuszálja.
    • a) Megvilágító: Ha van, általában alacsony feszültségű halogén lámpa. De sok modell természetes fényt is használ, és tükör segítségével a nyílás felé irányítja őket.

    Az összetett mikroszkóp munkamenete

    A minta felszerelése és összetett mikroszkóppal történő megfigyelése a következőképpen történik:
    1. A biológiai mintát glicerinbe vagy vízbe mártott átlátszó üveglemezre szereljük, és fedőlemezzel lefedjük.
    2. Egy ilyen kész tárgylemezt ezután fel kell szerelni a tárgyasztalra a kondenzátor és az objektívlencse közé.
    3. Reflektortükör és kondenzátor segítségével látható fénysugarat fókuszálunk a mintára.
    4. Az írisz rekesznyílása is állítható a fény mennyiségének szabályozására.
    5. A szükséges nagyítástól függően válasszon objektívet (a forgó orrrészre rögzítve). A (< m<100x>>) objektív lencséknél olajmerítés szükséges a mintán.
    6. Az objektívlencse ezután felveszi a fényt a mintán keresztül, és a megfigyelő megtekintheti a képet a szemlencsén keresztül
    7. A kép nagyítása és felbontása alapján egy durva és finom beállító gombbal lehet tiszta képet kapni.
    8. Ha olajmerítést használunk, akkor az objektívlencsét, a mintát és a tárgyasztalt egy pamut kendővel le kell törölni.

    Különbség az egyszerű és az összetett mikroszkóp között

    Egyszerű mikroszkópÖsszetett mikroszkóp
    (1)Egy lencsét használKét lencse rendszert használ
    (2)Csak egy lencse van jelen(3) - (5) objektívek vannak jelen, és egy vagy két szemlencse van jelen
    (3)A nagyítás az egyetlen használt objektívre korlátozódikA nagyítás a szemlencse és az objektív nagyításának többszörözése
    (4)Kondenzátorlencse hiányzikA kondenzátorlencse a mintába jutó fény intenzitásának szabályozására szolgál
    (5)A durva beállítások nagyon korlátozottak, míg a finombeállítás nem lehetségesA durva és finom beállítások a tiszta kép érdekében jók, és koaxiális gombbal történik
    (6)A fényforrás természetesA fényforrás lehet természetes vagy mesterséges (halogén izzók)
    (7)A tükör homorú, tükröződő típusúA tükör egyik oldalán sík, másik oldalán homorú

    A fénymikroszkópos technikák

    A fénymikroszkópiának vagy az optikai mikroszkópiának számos technikája van, amelyeket a szükséges kontraszt vagy a minta kiemelendő része alapján fejlesztettek ki. Mindezek a változatok meghatározott célokra készültek. Néhány közülük:

    Brightfield mikroszkóp: A közönséges diákmikroszkópot vagy fénymikroszkópot fényerejű mikroszkópnak nevezik, mivel a kép erősen megvilágított mezővel szemben jön létre.

    • 1. A minta sűrűbb és kissé átlátszatlan, mint a környezet.
    • 2. Az ilyen mintán áthaladó fény elnyelődik.
    • 3. A Brightfield mikroszkópiát tartósított, festett vagy akár élő biológiai minták megfigyelésére használják.
    • 4. Ennek az egyszerű mikroszkóptípusnak az előnyei a könnyű kezelhetőség és a minimális minta-előkészítés.
    • 5. Hátránya, hogy a felbontás alacsony marad.

    Sötét mező mikroszkóp: Az optikai mikroszkópiában a sötét mező technikát használják a kontraszt fokozására egy festetlen mintában.

    • 1. A közvetlenül áteresztő fényt minimalizáljuk, helyette a minta által szórt fényt használják fel a kép kialakítására.
    • 2. Ez a klasszikus sötét, majdnem fekete hátteret eredményezi, világos tárgyakkal, és innen ered a név sötét mező mikroszkóppal.
    • 3. Élő példányok megfigyelésére használható.

    Fáziskontraszt mikroszkóp: A biológiai mintákban enyhe különbség van a sejt vagy sejtrészek és a környező közeg törésmutatója (R.I) között, ami korlátozza annak fókuszát és felbontását. Ezt a különbséget a fáziskontraszt mikroszkópokban használják fel.

    • 1. A minta által elhajló fény és a környezetből származó el nem szórt fény közötti fáziskülönbségeket a fényerő-változások létrehozására használják fel.
    • 2. Ez különösen a sejtszerkezetek, például a sejtmagok megtekintésére szolgál, amelyek egyébként láthatatlanok a fényes terű mikroszkóppal.
    • 3. A fáziskontraszt mikroszkóp lehetővé tette a biológusok számára az élő sejtek tanulmányozását, akárcsak a sejtosztódás során.

    Interferencia mikroszkóp: Az interferencia-mikroszkópia prizmát használ, hogy a fényt két enyhén eltérő sugárnyalábra osztja, amelyek aztán áthaladnak a mintán.

    • 1. Ez tehát a két nyaláb újrakombinációja során a törésmutató különbségeinek mérésén alapul.
    • 2. Interferencia akkor lép fel, ha egy fénysugár késleltetett vagy előrehaladott a másikhoz képest.
    • 3. Az interferencia-mikroszkópia jobb, mint a fáziskontraszt mikroszkóp.

    Fluoreszcens mikroszkóp: Az ilyen típusú mikroszkóp a fluoreszkáló mintákat/mintákat használja.

    • 1. Egy hullámhosszúságú fényt használnak a minta megvilágítására, a mintából kibocsátott fényt pedig kép létrehozására.
    • 2. A sejteket vagy sejtrészeket fluoreszcens festékekkel jelöljük.
    • 3. Ezt a módszert a modern élettudományi tanulmányokban alkalmazzák, mivel rendkívül érzékeny, így akár egyetlen molekula kimutatását is lehetővé teszi.

    Polarizációs mikroszkóp: Ezek hagyományos mikroszkópok, de van egy további funkciójuk a polarizáló fény használatára.

    • 1. A polarizációs szűrő lehetővé teszi a fény polarizálását, majd a tárgy megvilágítását.
    • 2. Ha a tárgy kettős törő, akkor a fényt két különböző polarizációjú sugárnyalábra osztja.
    • 3. A szemlencse alá szerelt szűrő egy kivételével az összes polarizált fényt blokkolja.
    • 4. Az analizátor elforgatható a maximális kontraszt eléréséhez a jobb kép érdekében.
    • 5. Ezt a fajta mikroszkópiát a sejtekben található natív molekuláris szerkezetek orientációjának meghatározására és az élőlények korai fejlődési szakaszainak elemzésére használják.

    Más típusú mikroszkópok

    1. Elektronmikroszkóp: Az alapvető különbség a fénymikroszkóp és az elektronmikroszkóp között az, hogy az elektronmikroszkóp nem látható fényt, hanem elektronsugarat használ. Az elektronok hullámhossza sokkal rövidebb, mint a látható fényé, és ez lehetővé teszi, hogy az elektronmikroszkópok nagyobb felbontású képeket készítsenek, mint a hagyományos fénymikroszkópok.

    2. Jól megfigyelhetőek a szubcelluláris struktúrák és azok részletei.

    3. Az elektronmikroszkópok legnagyobb hátránya, hogy élő sejteket nem lehet megfigyelni, mivel a mintákat kiterjedt rögzítési eljárással kell előkészíteni.

    4. Az elektronmikroszkópoknak két fő típusa van: pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) és transzmissziós elektronmikroszkóp

    (a) Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM): egy elektronsugár ide-oda mozgatja a sejt vagy szövet felületét, és nagyon szép (< m<3D>>) képet ad. A keresőoptimalizálás legjobb felbontása (2011) évben (0,4,< m>)

    (b) Transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM): a mintát nagyon vékony szeletekre vágják, és az elektronnyaláb átfut a mintán. A TEM-et a sejtszervecskék szerkezetének megismerésére használják.

    5. Az elektronmikroszkópok nehezebbek, terjedelmesebbek és nagyon drágák, mint a fénymikroszkópok. Ezenkívül a minták előkészítése kiterjedt és időigényes folyamat.

    Ultraibolya (UV) mikroszkópok: Ultraibolya fényt használ a minták megvilágítására. Az ultraibolya sugárzás hullámhossza sokkal rövidebb, mint a látható fényé, és nagyon nagy felbontású képeket lehet készíteni. Ez a fajta mikroszkópia különösen hasznos a fehérjekristályok növekedésének megismerésére.

    Infravörös mikroszkópok: Az infravörös hullámhosszal végzett mikroszkópiát infravörös mikroszkópiának nevezik. Széles körben használják a kutatásban, az iparban, és az egyik alkalmazási terület a polgári és büntetőügyek kriminalisztika. Annak kimutatására szolgál, hogy két minta azonos-e vagy sem.

    Konfokális lézermikroszkópok: A lézeres fényforrásokat különféle típusú mikroszkópokban használják. Ez egy feltörekvő terület. A konfokális mikroszkópot ott alkalmazzák, ahol a (< m<3D>>) struktúrák fontosak.

    A mikroszkópia jelentősége

    A mikroszkópia jelentősége a következő:


    1. A mikroszkópiát széles körben alkalmazzák a biológiában és az orvostudományban.
    2. Elsősorban a szöveti és sejtszintű szerkezetek megismerésére használják.
    3. A szubcelluláris struktúrákat különböző típusú mikroszkópok segítségével is feltárják.
    4. Infravörös mikroszkópokat használnak annak kimutatására, hogy két minta azonos-e vagy sem.
    5. Az UV-mikroszkópia különösen hasznos a fehérjekristályok növekedésének megismerésére.
    6. A sötéttér-mikroszkópia hasznos élő minták megfigyelésére.
    7. A konfokális mikroszkópiát ott alkalmazzák, ahol a (< m<3D>>) struktúrák fontosak.
    8. A fluoreszcencia mikroszkópiát a jelek egymolekulás szintű kimutatására használják.

    Összefoglaló a mikroszkópiáról

    A mai tudományos világban a mikroszkóp a biológiai tudományok és az orvostudomány területén általánosan használt eszköz. Egyszerű egysejtű élőlények, különféle biológiai szövetek megfigyelésétől a nagyon nagy felbontású szubcelluláris struktúrákig alkalmazzák. A mikroszkópiát a biológiai tudományokban és az orvostudományban óriási mértékben alkalmazzák, és maga a terület magával ragadó és elbűvölő.

    A kontraszt és az érzékenység fluoreszcens mikroszkópiájában a közelmúltban elért eredmények olyan mértékűek, hogy a tudósok képesek a jelek egyetlen molekula szintjén történő észlelésére. Elektronmikroszkópok, bár nehezebbek és drágábbak, nagy áteresztőképességű vizsgálatokhoz szükségesek, ahol extrém nagyítási szintre van szükség. A molekuláris képalkotás és a sejtképalkotás új hívószavak lettek. A szövettani technikák új fejlesztései, az általánosan használt festékek és foltok, valamint a különféle fluorokrómok kifejlesztése lehetővé teszi a tudósok számára, hogy új nagyításokkal fedezzék fel a minket körülvevő élővilágot.

    Gyakran Ismételt Kérdések (GYIK) Be Mikroszkópia

    Q.1. Mi a mikroszkópia?
    Válasz:A mikroszkóp a tudomány azon ága, amely különböző típusú mikroszkópokat használ olyan tárgyak megtekintésére, amelyek egyébként szabad szemmel láthatatlanok.

    Q.2. Wa mikroszkópok típusai?
    Válasz: A tudományokban különféle típusú mikroszkópokat használnak. A legelterjedtebb az összetett fénymikroszkóp. Fénymikroszkópok, elektronmikroszkópok, konfokális lézermikroszkópok néhány további példa.

    Q.3. Mire használható a mikroszkóp?
    Válasz:A mikroszkópia széles körben alkalmazható a biológiában és az orvostudományban. Elsősorban a szöveti és sejtszintű struktúrák megismerésére használják. A szubcelluláris struktúrákat különféle típusú mikroszkópok segítségével is feltárják.

    Q.4. Mi az egyszerű mikroszkóp elve?
    Válasz:Egy egyszerű mikroszkóp azt az elvet használja, hogy amikor egy tárgyat a gyújtótávolságán belül helyeznek el, virtuális, egyenes és nagyított képe keletkezik a tárgyról.

    Q.5. Mi a mikroszkópok két fő típusa?
    Válasz: Az egyszerű egylencsés mikroszkóp és az összetett vagy kétlencsés mikroszkóp a fénymikroszkópok két fő típusa.

    Q.6. Melyek a mikroszkóp (14) részei?
    Válasz: A következő képen egy összetett mikroszkóp összes része látható.

    Q.7. Melyik a leggyakrabban használt mikroszkóp a laboratóriumokban?
    Válasz:Az összetett mikroszkóp, amelyet diákmikroszkópnak is neveznek, a laboratóriumokban leggyakrabban használt mikroszkóp.

    Most, hogy minden szükséges információval rendelkezik a mikroszkóppal kapcsolatban, és reméljük, hogy ez a részletes cikk hasznos lesz az Ön számára. Ha bármilyen kérdése van a mikroszkóppal kapcsolatban, írjon nekünk az alábbi megjegyzés rovatban, és a lehető leghamarabb felvesszük Önnel a kapcsolatot.


    MIKROSZKÓPIA | Fáziskontrasztmikroszkópia

    Zernike fáziskontraszt

    A Zernike fáziskontraszt módszere hasonló a sötét mezőhöz, azzal a különbséggel, hogy a közvetlen (nem diffrakciós) fény relatív fázisa 90°-kal megváltozik, inkább kiküszöbölve. A gyakorlatban ezt egy gyűrű alakú kondenzátornyílás és egy fázisgyűrűs objektív segítségével érik el (2. ábra). A fázisváltozás ±90° lehet, ami pozitív vagy negatív fáziskontrasztot ad. A fázisgyűrű általában csak részben sugároz, aminek az érzékenysége fokozódik. A [8] vagy [11] egyenletekből egy gyenge objektum képalkotása lineáris fázisú. A halo műtermék jelen van, mint a sötétterű mikroszkópban. Gyenge amplitúdójú információ a sötét mező mikroszkópiához hasonlóan jelenik meg.

    2. ábra . A Zernike fáziskontrasztmikroszkópia sematikus diagramja.

    Az eqn [12] gyenge fázisú objektum esetében tehát megvan

    pozitív vagy negatív fáziskontraszt esetén, ahol g a fázisgyűrű amplitúdó-átbocsátása. A gyenge tárgyátviteli funkció reakciója a gyűrű alakú kondenzátornyílásnak köszönhetően javul.


    Mennyire használják a fáziskontraszt és a sötétmezős mikroszkópot a biológiai kutatásokban? - Biológia

    A fáziskontraszt és a differenciális interferencia-kontraszt (DIC) mikroszkóp olyan kiegészítő technikák, amelyek képesek nagy kontrasztú képeket készíteni az átlátszó biológiai fázisokról, amelyek általában nem befolyásolják a mintán áthaladó látható fényhullámok amplitúdóját. Mivel a fáziskülönbségek az emberi szem számára nem észlelhetők, és fényes terű megvilágítás mellett mikroszkópban nem könnyen észlelhetők, a mikroszkópon áthaladó fényút megfelelően módosítani kell, hogy kielégítő képeket kapjunk a fázismintákról. Sok népszerű kontrasztfokozó technika a fázisminták azon képességén alapul, hogy módosítani tudják a biológiai anyagot áthaladó és a környező közegen áthaladó hullámok közötti optikai útkülönbséget.

    Talán a legalapvetőbb különbség a differenciális interferenciakontraszt és a fáziskontraszt mikroszkópia között az az optikai alap, amelyen a képeket a komplementer technikákkal alkotják. A fáziskontraszt a minta optikai úthosszának függvényében képintenzitás-értékeket ad, a nagyon sűrű (nagy úthosszúságú) régiók pedig sötétebbnek tűnnek, mint a háttér. Alternatív megoldásként a viszonylag kis vastagságú, vagy a környező közegénél kisebb törésmutatójú mintaelemek sokkal világosabbá válnak, ha a közepes szürke háttérre helyezik őket.

    Egészen más a helyzet a differenciális interferenciakontraszt esetében, ahol az optikai úthossz-gradiensek (valójában a hullámfront nyírási irányának változási sebessége) elsősorban a kontraszt beviteléért felelősek a mintaképeken. Az úthossz meredek színátmenetei kiváló kontrasztot hoznak létre, a képek pedig a DIC technikára jellemző pszeudo háromdimenziós dombormű-árnyékolást jelenítenek meg. A nagyon sekély optikai útvonal meredekségei, például a kiterjedt, lapos mintákon megfigyelhető területek jelentéktelen kontrasztot produkálnak, és gyakran a háttérrel azonos intenzitású képen jelennek meg.

    A kontrasztképzési mechanizmusok különbségein kívül a DIC és a fáziskontraszt képek számos más tulajdonságban is különböznek. Az 1. ábrán számos digitális kép látható, amelyek összehasonlítják a DIC-ben és a fáziskontrasztban rögzített mintákat. Az 1(a) ábrán egy humán szájnyálkahártya epiteliális (pofa) sejtje látható, amely felfedi a sejtmagot, a citoplazma zárványait és számos baktériumot a felső felületén, és differenciális interferenciakontraszttal ábrázolva. Ugyanez a látómező fáziskontrasztos megvilágítással az 1(b) ábrán látható. A fáziskontrasztos kép kifejezett fényudvarokat tartalmaz a sejtperiféria és a sejtmag körül, amelyek hiányoznak a differenciális interferencia-kontraszt képen. Az optikai metszetes DIC mikroszkópos vizsgálatok (nincs ábrázolva) azt mutatják, hogy a baktériumok (majdnem kizárólag) a membrán felületén vannak jelen, amelyet a környező közegben fürdőznek, nem pedig a sejt alsó oldalán. Ez a tény fáziskontraszttal nem határozható meg egyértelműen.

    Az 1(c) ábrán az egérveseszövet vastag metszete differenciális interferenciakontraszttal leképezve egy tubulusba zárt sejtköteget mutat. Az azonos területről készült fáziskontrasztos kép (1(d) ábra) zavaró és zavaró a fókuszsíkon kívüli fázishalók jelenléte miatt. A fáziskontraszt képen azonban számos sejtmag látható, amelyek nem különböztethetők meg a DIC-ben. Az 1(e) és 1(f) ábrákon egy Obelia polipoid gyűrűs szárperisark viszonylag nagy nagyítása látható DIC-ben és fáziskontrasztban. A DIC-ben (1(e) ábra) a gyűrű alakú szerkezet félgömb alakúnak tűnik, a szárból sugárirányban kiinduló belső sugarak. Ezenkívül szemcsés részecskék láthatók a szár szerkezetében, de az anatómiai részletek nagyrészt meghatározatlanok. A fáziskontraszt képet (1(f) ábra) összezavarják a gyűrű alakú gyűrűk körül és a száron belüli fényudvarok.

    A differenciális interferenciakontraszt elsődleges előnye a fáziskontraszttal szemben, hogy a műszert teljes numerikus apertúrával lehet használni a fázislemezek vagy a kondenzátorgyűrűk maszkoló hatása nélkül, amelyek súlyosan korlátozzák a kondenzátor és az objektív nyílások méretét. A fő előny a jobb axiális felbontás, különösen ami a DIC mikroszkóp azon képességét illeti, hogy kiváló, nagy felbontású képeket készítsen nagy rekesznyílás mellett. A 2. ábrán az objektív hátsó rekesznyílásáról Bertrand-lencsével készített digitális képek láthatók differenciális interferenciakontraszt (2(a) ábra) és fáziskontraszt (2(b) ábra) mikroszkóppal. Mindkét esetben az objektív egy 40-szeres fluorit, amelynek numerikus apertúrája 0,75, és a kondenzátor nyílás membránja a legnagyobb átmérőre van nyitva. Még akkor is, ha a polarizátor a helyén van, és a kondenzátorba egy Nomarski-prizma van telepítve, a DIC rekesz sokkal nagyobb, mint a fáziskontraszt apertúra, elsősorban azért, mert a fáziskondenzátor gyűrűje korlátozza a megvilágítás jelentős részét, amely általában áthaladna a mikroszkóp optikai sorozatán.

    A fáziskontrasztból hiányzik a differenciális interferenciakontrasztban rejlő kifejezett azimutális hatás, amely a nyalábosztó Nomarski (vagy módosított Wollaston) prizmák aszimmetrikus orientációjában nyilvánul meg a mikroszkóp optikai tengelyéhez és a polarizátorokhoz képest. Az orientációs hatás hiánya azért következik be, mert a fáziskontraszt mikroszkóp kondenzátorában (2(b) ábra) a gyűrű alakú fázislemez 360 fokban forgásszimmetrikus, és minden szögből egyenletesen megvilágítja a mintát. Ennek eredményeként a fáziskontraszt kép független a tájolástól, és nincs kitéve a forgástól függő kontraszthatásoknak. Számos, differenciális interferenciakontraszttal leképezett minta esetében a maximális kontraszt eléréséhez szükséges előfeltétel (a nyírási tengellyel párhuzamos vagy merőleges) orientáció korlátozza a minta elforgatásának szabadságát, különösen lineáris vagy szorosan elhelyezkedő periodikus struktúrák esetén.

    A differenciális interferencia-kontraszt azimutkontraszt hatásai előnyösen hasznosíthatók, ha a mikroszkópot 360 fokban forgó kör alakú próbatesttel szerelik fel. Eredetileg polarizált fénymikroszkópos megfigyelésekre tervezték, a körkörös fokozatok lehetővé teszik a kezelő számára a minta elforgatását a prizma nyírási tengelyéhez képest, hogy maximalizálja vagy minimalizálja a kontraszthatásokat a kiválasztott minta jellemzőinél. A DIC mikroszkópos kontraszt minimális szintet ér el olyan lineáris fázisú mintáknál, amelyek a nyírás iránya mentén nyúlnak el, de a tárgyasztal néhány fokkal történő elforgatásával jelentősen változtatható. A nem lineáris minták, mint például a sejtek, szövetmetszetek, részecskék és amorf polimerek, nem mutatnak jelentős azimuthatást a DIC-ben, és általában kielégítően leképezhetők különböző tájolásokban.

    A 3. ábrán két lineáris minta látható, amelyek jelentős periodicitást és aszimmetriát mutatnak mind a fáziskontrasztban, mind a DIC-ben. Mindkét esetben a DIC-ből nyert képek kontrasztja nagymértékben függ a mintának a mikroszkóp nyírási tengelyéhez viszonyított orientációjától, míg a fáziskontraszt kép jellemzői függetlenek a minta elfordulásától a mikroszkóp optikai tengelye körül. A 3(a) és 3(b) ábrán látható képeket DIC-ben kaptuk egy kétoldalilag szimmetrikus, megnyúlt kovahalvány pennate csonka mintáról. Ha a diatóma hosszú tengelye párhuzamosan van a Nomarski-prizma nyírási tengelyével (3(a) ábra), akkor a csonka bordái és pórusai könnyen megfigyelhetők. A 3(a) ábra jobb felső sarkában lévő fehér nyíl a Nomarski-prizma nyírási tengelyét jelöli a 3. ábrán látható DIC-képeknél. A kovamoszat 90 fokkal történő elforgatása (a nyírási tengelyre merőlegesen) csökkenti a kontrasztot a csonka képen. és eltakarja a mikroszerkezetben jelenlévő fontos részleteket. Például a 3(a) ábrán a csonka szélein és közepén jól megfigyelhető hosszanti bordák a 3(b) ábrán hiányoznak. Az azimuthatások hiányoznak ugyanabban a mintában, ha fáziskontraszt optikai rendszert használnak (3(c) ábra), amely hasonló kontrasztot jelenít meg, függetlenül a minta tájolásától. Megjegyzendő, hogy a 3(c) ábrán látható képkontraszt jobban hasonlít a 3(b) ábrán látható DIC-képhez, mint a 3(a) ábrán látható nagy kontrasztú képhez. Ebben az esetben a minta tájolásából adódó azimutális hatások előnyei a differenciális interferenciakontrasztban egyértelműen nyilvánvalóak.

    A DIC-ben jelenlévő, de fáziskontraszt hiányzó azimuthatások második példája a 3(d)-3(f) ábrákon látható. A minta egy félig átlátszó ctenoid halpikkely, amely rombusz alakú zárványokat tartalmaz, amelyekben erősen hiányzik a kontraszt, és nehéz megkülönböztetni, ha a pikkely harántcsíkolt testtüskéire helyezik őket. Ha a ctenoid skála úgy van orientálva, hogy a test tüskéi párhuzamosak a nyírási tengellyel egy DIC mikroszkópban (3(d) ábra), akkor az átlátszó téglalap alakú zárványok láthatóvá válnak, és elfedik a test tüskéit. A mikroszkóp tárgyasztalának 90 fokkal történő elforgatása csökkenti a zárványok kontrasztszintjét, és jól láthatóvá válnak a harántcsíkolt tüskék (3(e) ábra). Fáziskontrasztban (3(f) ábra) a zárványok a kísérő glóriákkal, valamint a csíkozott tüskék jelen vannak, függetlenül a minta tájolásától.

    A képkontraszt és a minta tájolása közötti összefüggés a differenciális interferenciakontrasztban gyakran előnyösen hasznosítható kiterjesztett lineáris minták vizsgálatánál. Például a kovaalgcsontok és hasonló példányok erősen rendezett struktúrái átfedhetik egymást, ami zavaros képeket eredményezhet, ha fáziskontrasztban és hasonló kontrasztfokozó technikákkal figyelik őket. A különböző tájolású képek rögzítésével a DIC-mikroszkópia gyakran képes tisztább megérteni a sok kiterjesztett, lineáris mintában jelenlévő összetett morfológiát. Ezen túlmenően, amikor az optikai metszetkészítési módszert azimut-specifikus képalkotáshoz kapcsolják, a differenciális interferencia-kontrasztmikroszkópia gyakran felfedhet olyan jellemzőket, amelyeket nehéz vagy lehetetlen megkülönböztetni alternatív technikákkal.

    Halo és Shade-Off Artifacts

    A fáziskontraszt optikai rendszert sújtó halo és árnyékolt műtermékek nagyrészt hiányoznak a differenciális interferencia kontrasztos képeken. Pozitív fáziskontraszt esetén a környező közegnél magasabb törésmutatójú mintaelemeket fényes perem (halo) veszi körül, amely gyakran eltakarja az élrészleteket. Bár a fényudvarok korlátozott mértékben elnyomhatók az objektív fázislemez kialakításának konfigurációs módosításaival, ezeket nem lehet teljesen kiküszöbölni. Egyes esetekben a differenciális interferencia-kontrasztos képek túlzott fényességgel rendelkeznek a nagyon meredek optikai gradiensekkel rendelkező élek mentén, de ez a hatás általában akkor jelentkezik, ha az előfeszítési késleltetési értékek túl alacsonyak, és a Nomarski prizma (vagy de S narmont) megfelelő beállításával megkerülhető. kompenzátor polarizátor) helyzete.

    A halók jelenléte és súlyossága a fáziskontrasztban részben a minta és a környező közeg közötti törésmutató különbségétől függ. A fáziskontraszt minták gyakran sokféle szerkezetet tartalmaznak, amelyek vadul ingadozó törésmutatókat mutatnak, amelyek együttesen összetett képeket eredményeznek. A környező közegnél alacsonyabb törésmutatóval rendelkező területek sötét fényudvarral rendelkeznek, szemben a magasabb törésmutatójú jellemzőket körülvevő fényes fényudvarokkal. A halók a fáziskontraszt mikroszkóp optikai rendszer konfigurációs paraméterei miatt keletkeznek. A minta által eltért beeső fény egy kis része áthalad az objektív fázislemezen a szórt hullámfrontok gömbi jellege miatt. A kisebb mintaelemek nagyobb diffrakciós szögeket eredményeznek, de a nagy kiterjedt szerkezetek kisebb szögű diffrakciós hullámfrontokat hozhatnak létre, amelyek gyakran a fázislemezek által elfoglalt objektív apertúra zónába esnek.

    A fáziskontraszt és a DIC-képek összehasonlítása a halo műtermékek tekintetében a 4. ábrán látható három általánosan leképezett átlátszó minta esetében. Az emberi eritrociták (vörösvérsejtek) megkülönböztető fényudvarral veszik körül a korong alakú sejteket, ha pozitív fáziskontrasztban, közepes és nagy nagyításnál ábrázolják őket (4(a) ábra). Vegye figyelembe, hogy az eritrocita korongok központi része világosabb, mint a periféria, mivel ebben a régióban csökken az optikai út. Ha ugyanazt a látóteret differenciális interferencia-kontrasztban vizsgáljuk (4(b) ábra), akkor a sejteket körülvevő halo műtermékek hiányoznak, de a képek a Nomarski-prizma nyírási tengelye mentén (északnyugattól délkelet felé) elhelyezkedő árnyékos megjelenést kapnak. abban nyilvánul meg, hogy a külső bordák bal felső része sokkal világosabb megjelenésű, mint a sejtek ellenkező oldalán (jobb alsó) lévő megfelelő bordák.

    Az egyrétegű tenyészetben növesztett élő sejteket gyakran megfigyelik és leképezik mind fáziskontraszt, mind differenciális interferenciakontraszt mikroszkóppal. Az üveg fedőlemezeken lévő tenyészetben számos tapadó HeLa sejtet a 4(c) ábra szemléltet fáziskontraszt optikával. A halo műtermékek a sejtmembránok perifériáját veszik körül, és a sejten belüli nagyobb organellumok némelyikén is nyilvánvalóak. Bár ezen a képen sok belső sejtrészlet nagy felbontásban van jelen, az intracelluláris összehúzódásokkal kapcsolatos információkat elnyomják a szomszédos sejtmembránok között megjelenő világos (halo) régiók. A halo műtermékek hiánya nyilvánvaló ugyanabban a látómezőben (4(d) ábra), ha differenciális interferenciakontraszttal készítjük a képet. A sejtek belső részletei kevésbé nyilvánvalóak a DIC-ben, de a sejtmembránok perifériája tisztábban látható, mint a fáziskontraszt esetén. Valójában a szomszédos sejtek közelsége nagyon nyilvánvaló a DIC-képen, ami pontosabbá teszi a technikát az intercelluláris események, például az érintkezésgátlás tanulmányozására.

    A fonalas zöld alga nemzetség, a Zygnema tagjai megnyúlt, lineáris szerkezetet mutatnak, amely ismétlődő egyedi sejtegységekből áll. Fáziskontrasztban (4(e) ábra) a fonalas Zygnema minták kifejezett fényudvarral vannak körülvéve a rúdszerű algaszálak külsejében, de jelentős belső részleteket is tartalmaznak, amelyeket a halo műtermék eltakar. A biszimmetrikus U-alakú ismétlődő belső sejtstruktúrák (4(e) ábra) nagy fényudvarokat eredményeznek, amelyek jelentősen csökkentik a kontrasztot és elfedik a kisebb jellemzőket. A differenciális interferenciakontraszt kiküszöböli a Zygnema fáziskontrasztos képén jelenlévő halo műtermékeket (4(f) ábra), és lényegesen többet tár fel az izzószál közepén lévő belső részletekből. A Zygnema filamentum szerkezetére vonatkozó legmeghatározóbb következtetések levonásához azonban a két képalkotó technikát együtt kell alkalmazni (ahogyan a fent leírt minták közül sok esetében).

    Amint azt fentebb tárgyaltuk, a mintaelemek, amelyek törésmutatója magasabb, mint a környező közeg, fényes fényudvarokat jelenítenek meg a periférián, és sötétebb középső részeket mutatnak, ha pozitív fáziskontraszt optikai rendszerekkel ábrázolják. Az ellenkező hatás akkor következik be, ha a közegnél alacsonyabb törésmutatójú jellemzőket észlelünk (sötét fényudvarok és világos belső régiók). A halo effektusok a minta jellemzőjének méretétől függően változnak, és nagymértékben függenek a minta és a környező közeg közötti törésmutató különbségétől. A törésmutató nagyobb eltérései hajlamosak kifejezettebb haloeffektusokat generálni, amelyek a műszer paramétereitől is függenek, mint például a fázislemez méreteitől és a semleges sűrűségtől, valamint az objektív nagyítási tényezőjétől. Ezenkívül a minta jellemzőinek mérete kiemelkedő szerepet játszik a halo műtermékek súlyosságának meghatározásában fáziskontraszt mikroszkóppal.

    Egészen más a helyzet a DIC mikroszkópiában, ahol a nagy törésmutató különbségek és a minta jellemzői nem rontják a képminőséget.Valójában a minta és a környező közeg közötti kifejezett törésmutató-különbségek gyakran nagyon kívánatosak, és általában kiváló képeket eredményeznek a különböző interferenciakontrasztban. A jellemző mérete általában nem jelent problémát a DIC-mikroszkópiában. A nagy méret- és törésmutató-ingadozású minták gyakran egyidejűleg (egymás mellett) leképezhetők differenciális interferencia-kontraszt optikai rendszerekkel, hogy kiváló kontrasztú struktúrákat kapjunk, amelyek lehetővé teszik a legapróbb részletek megfigyelését és felismerését is.

    A halo műtermékeket és a képkontrasztot a minta optikai vastagsága is sokkal nagyobb mértékben befolyásolja fáziskontrasztban, mint a DIC mikroszkópban. Nagy optikai útkülönbségek esetén (legfeljebb fél hullámhosszig) kétértelmű fáziskontrasztos képek készíthetők, mivel a minta legvastagabb elemei gyakran olyan kontrasztszinteket jelenítenek meg, amelyek nagyon közel állnak a legvékonyabb jellemzőkhöz, vagy megegyeznek azzal. Ez az optikai úthossz (mintavastagság és törésmutató), a kontraszt és a fázisszögek közötti összetett összefüggésekből adódik. Általánosságban elmondható, hogy az ideális fáziskontraszt minták jellemzői nem haladhatják meg az egytized hullámhosszt az optikai útkülönbségben. Vékony minták is kívánatosak a DIC mikroszkópiához, de a technika alkalmas arra, hogy megfelelő képeket készítsen olyan mintákkal, amelyek vastagsága (és optikai úthossza) sokkal nagyobb, mint a fáziskontraszthoz ajánlott. A nagyon vastag minták azonban negatívan befolyásolhatják az interferenciasíkok átfedését az objektív és a kondenzátor prizma között, csökkentve a DIC-képek minőségét és kontrasztját.

    Lapos, kinyújtott, egyenletes optikai úthosszúságú mintákon a fáziskontraszt mikroszkópiában általában egy árnyékolás néven ismert műtermék figyelhető meg. Az árnyékolás abban nyilvánul meg, hogy a minta középső része a kontraszt fokozatos csökkenését mutatja, amíg az intenzitás megközelíti a környező közeg intenzitását. Szélsőséges esetekben a kiterjesztett példányok csak fáziskontrasztban lesznek láthatóak fényudvaruk jelenléte miatt. A DIC-ben a képintenzitás változása csak akkor következik be, ha az optikai útkülönbség jelentősen megváltozik, és gyakran a kiterjesztett minták határai az egyetlen jellemző, amelyet ezzel a technikával lehet felismerni.

    Mélységélesség és optikai metszés

    Mivel a fáziskontrasztos képek homályossá válhatnak (sőt a kontraszt megfordulását tapasztalhatják), ha a minta optikai úthossza nagy tartományban ingadozik, a technikát olyan mintákra kell korlátozni, amelyek útkülönbsége legfeljebb egytized hullámhosszú, mint korábban tárgyaltuk. . Más szóval, a vastag vagy ék alakú minták általában nem alkalmasak fáziskontraszt mikroszkópos kvantitatív vizsgálatokra. A vékony próbatestek is hajlamosak jobb képeket produkálni differenciális interferenciakontrasztban, de a vastagabb minták (amelyek optikai útkülönbsége egytized és egy teljes hullámhossz között van) széles rekesznyílásokon is leképezhető optikai metszeti technikákkal.

    A fáziskontraszt megvilágítási apertúráját a kondenzátor gyűrűjének mérete határozza meg, és nem változtatható a mélységélesség növelése vagy csökkentése érdekében. Ez a korlátozás akadályozza a jelentős halo műtermékeket tartalmazó minták megfigyelését, amelyek néha elfedhetik a fókuszált minta jellemzőit az objektív fókuszsíkon kívülről származó túlzott fényből származó átfedő részletek miatt. Ilyen problémák gyakran akkor merülnek fel, amikor olyan mintákat próbálunk leképezni, amelyek túl vastagok a fáziskontraszthoz. Azonban, amint azt korábban tárgyaltuk, a differenciális interferencia-kontrasztmikroszkóp optikai metszeti képessége (széles kondenzátornyílás-méreteknél) lehetővé teszi kiváló képek készítését viszonylag vastag mintákkal.

    A vastag próbatestekből származó nagy apertúrájú optikai metszetek előnyeit a differenciális interferenciakontrasztban az 5. ábra szemlélteti, és összehasonlítja a fáziskontraszttal képzett azonos látómezőkkel. Az 5(b) ábra az Obelia hidrozoán reproduktív polipjából származó medusa rügyet szemlélteti nagy nagyítással DIC-ben, és a kondenzátor írisz diafragma nyílása az objektív nyílás méretének körülbelül 95 százalékára van beállítva. Az így kapott vékony optikai metszet élesen fókuszált képrészleteket tár fel a medúza jellemzőiről, amelyeket csak minimálisan takar el a fókuszsíktól távolodó fény. Ha ugyanazt a látómezőt fáziskontrasztban vizsgáljuk (5(a) ábra), a medusa képet fényudvarok homályosítják el, és az optikai rendszer korlátozott apertúrája miatt csökkentett felbontást mutat.

    Hasonló helyzeteket mutat be az 5(c)–5(f) ábra. Az 5(c) ábra az uralkodólepke (Danaus plexippus) átfedő szárnypikkelyeit ábrázolja, amely Észak-Amerika egyik leggyakoribb pillangója. Az egyes léptékek nem különböztethetők meg az 5(c) ábrán a halo műtermékek és a nem a fókusz síkjában lévő elmosódott jellemzők miatt. Általában a képet számos műtárgy zavarja, ami megnehezíti a minta jellemzőinek megfejtését. Ugyanannak a mintának a differenciális interferenciakontrasztban való leképezése (5(d) ábra) sok, a fókuszsíktól távolabb elhelyezkedő zavaró műterméket kiküszöböl, és egyértelműen behatárolja a felület jellemzőit egyetlen szárnyskálán. Hasonlóképpen, a kutyauborka galandféreg (Dipylidium caninum) hasában lévő tojáscsomag éles peremeket tár fel az egyes tojásokat körülvevő DIC-ben (5(f) ábra). A fókuszált tojások azonban nem rendelkeznek jellegzetes fáziskontraszt szerkezettel (5(e) ábra), elsősorban a fókuszsíktól távol elhelyezkedő többi tojás fényudvarának köszönhetően.

    A nagy kondenzátorrekeszméret és nagy numerikus apertúra esetén a differenciális interferencia-kontraszt optikai metszeti képessége kritikus fontosságú az egyes fókuszsíkok vastag fázisú mintákban történő leképezésénél. A közvetlen fókuszsíkon kívül eső elemek részletei és szórt fénye nem veszélyezteti a DIC-képeket ugyanúgy, mint a fáziskontrasztos képeket, amelyeket gyakran bonyolítanak a halo-termékek. Ennek eredményeként a differenciális interferenciakontraszt segítségével kiváló képeket lehet készíteni némileg kedvezőtlen körülmények között (nagyon vastag minták), még akkor is, ha a nagy mélységélesség miatt a fáziskontraszt mikroszkópiában a fázisszerkezetek azonosítása lehetetlenné válik az átfedő részletek miatt.

    A fáziskontraszt előnye a DIC-vel szemben, hogy sikeresen leképezheti a dikroikus és kettős törő mintákat. Mivel a differenciális interferencia-kontraszt optikai rendszerek polarizált fényre támaszkodnak a hullámfront-mezők orientációjának megállapításához, a hétköznapi és a rendkívüli hullámok eltérő abszorpciója kettős törő vagy dikroikus minta esetén zavaros képeket eredményez. A fáziskontraszt nem igényel polarizált fényt, és mentes a kettős törő minták által keltett optikai zavaroktól.

    A differenciális interferencia-kontrasztmikroszkópiában a kettős törés műtermékeivel kapcsolatos egyik elsődleges probléma a műanyag szövettenyésztő edények széles körben elterjedt használatából adódik. Az öntött polimer edény szerkezetében rejlő feszültség túlzott kettős törést okoz, ami depolarizálja a fényt és megzavarja a DIC képek értelmezését. Így az ezekben a tartályokban tenyésztett élő sejteket nem lehet kielégítően leképezni differenciális interferenciakontraszttal, hanem általában fáziskontrasztos vagy Hoffman-modulációs kontraszt optikai rendszerekkel figyelik meg és fényképezik őket.

    A kettős törő minták DIC-ben történő leképezéséből származó tipikus műtermékek a 6. ábrán láthatók, az azonos látómezők fáziskontrasztos képeivel együtt. A burgonya (Solanum tuberosum) szövetének négyszeresen festett vékony szakaszából származó keményítőtároló granulátumokat (gömbökként jelennek meg), amelyek szintén az érett gumó egy részét szemléltetik peridermával, kéreggel és csökkent érszövetekkel, a 6(a) ábrán és 6(b). Mivel a burgonyakeményítő szemekben lévő szénhidrátok rendezett lamelláris molekulaszerkezettel rendelkeznek, a szemek egy része (és bizonyos esetekben maga az egész szem) kettős törő, és elnyeli a polarizált hullámfrontokat, amelyek elhagyják a kondenzátor Nomarski prizmát és áthaladnak a mintán. Ennek eredményeként a DIC mikroszkóppal megfigyelt burgonyakeményítő szemcsék interferencia színeket és jellegzetes máltai keresztmintákat mutatnak (a keresztezett polarizátorokból erednek), amelyek jellemzőek a gömbszimmetriájú kettős törő anizotróp mintákra (6(b) ábra). A DIC-ben található kettős törési műtermék a keményítőszemcsék belső szerkezetének nagy részét elfedi, ami sokkal több részletet tár fel, ha fáziskontrasztban ábrázolják (6(a) ábra), még akkor is, ha a minta megfestődött.

    A 6(c) ábrán egyetlen műselyemszál fáziskontrasztos képe látható, amely a polimer felületén és belsejében egyaránt jelen lévő lyukas morfológiát mutatja. A műselymet cellulózból, pamutszálakból vagy faforgácsból állítják elő oly módon, hogy az ömlesztett anyagokat nátrium-hidroxiddal és szén-diszulfiddal kezelik, majd a kapott viszkózus oldatot fonókon vezetik át. Az ebben az eljárásban előállított szálak nagy hatótávolságúak, és általában nagyon erősen kettős törőek. A műselyemszál DIC-vizsgálata (6(d) ábra) megerősíti a kettős törő jelleget, amely a képen jelenlévő newtoni interferenciaszínekben nyilvánul meg. A színek, bár szépek, elfedik a minta részleteit, és csökkentik a DIC hasznosságát az ilyen típusú képalkotási anyagoknál. A 6(b) és 6(d) ábrákon bemutatott kettős törő képeket viszonylag vékony (5-20 mikrométeres) minták felhasználásával rögzítettük kis nagyítással (20x), amelyek éles fókuszban maradnak az egész látómezőben. Ha vastagabb kettős törő mintákat készítünk DIC-vel, akkor a fókuszponttól távolabb eső síkokból származó interferenciaszínek sokkal nagyobb mértékben takarják el a minta részleteit. Ezért a mintavastagság növekedésével (kettős törő minták esetén) a DIC-ben készített képek általában elveszítik a kontrasztot, és a minőség gyorsan romlik.

    A műanyag szövettenyésztő edényekben növesztett élő sejtek differenciális interferencia-kontrasztmikroszkóppal történő megfigyelésével kapcsolatos problémák egyértelműen nyilvánvalóak a 6(e) és 6(f) ábrák összehasonlításából. Számos indiai Muntjac (Muntiacus muntjak) szarvasbőr fibroblaszt sejtet egyrétegű tenyészetben szemléltet a 6(e) ábra, amelyet nagy munkatávolságú objektív és kondenzátor kombinációval ábrázoltunk fáziskontrasztban, fordított szövettenyésztő mikroszkópon. A sejteket öntött polisztirol edényekben növesztettük, amelyek felső és alsó falvastagsága körülbelül 1,2 mm (a polisztirol együttes vastagsága 2,4 mm). Még a vastag üvegen vagy műanyagon keresztüli megfigyelésre tervezett korrekciós gallérral rendelkező fáziskontraszt objektívek esetén is romlik a képminőség a vékony (170 mikrométeres) fedőüveglemezeken leképezett cellákhoz képest (hasonlítsa össze a 6(e) ábrát a 4(c) ábrával). ). A belső sejtrészletek nagy része azonban még mindig látható, beleértve a magokat, a sejtmagot, a vakuolusokat és számos kisebb részecskét.

    A differenciális interferenciakontrasztban a 6(e) ábrán bemutatott tenyésztett indiai Muntjac fibroblaszt sejtek jelentős mennyiségű kontrasztot veszítenek (6(f) ábra) a kettős törő polisztirol tartályból származó abszorpció és interferencia hatása miatt. Mivel a tartály falai viszonylag vastagok, a deformációs kettős törés depolarizálja a szokásos és rendkívüli hullámfrontokat a szövettenyésztőedény felső falában, mielőtt azok áthaladnának a sejteken, és még egyszer a sejtekből való kilépés és az alsó falon való áthaladás után. Az eredmény olyan erős kontrasztesés, hogy a sejteket csak akkor lehet leképezni, ha a kondenzátor membránja majdnem teljesen zárt (hasonlóan az átlátszó mintákkal végzett világosmezős technikákhoz). Ilyen körülmények között a képek számos diffrakciós műterméket mutatnak az alacsony kontraszt mellett, és gyakorlatilag használhatatlanná teszik a DIC-t az ilyen típusú megfigyelésekhez.

    A kettős törő minták differenciális interferencia-kontrasztmikroszkópos vizsgálata során a hibák fő forrása a polarizált fény használatának szükségessége, amint azt fentebb tárgyaltuk. A kettős törő mintákban a polarizált ortogonális (közönséges és rendkívüli) hullámfrontok különböző mértékben nyelődnek el, attól függően, hogy a mintán belüli anizotróp molekulákhoz képest milyen orientációjuk van. Ennek eredményeként, amikor az ortogonális hullámfrontokat az objektív Nomarski-prizmában rekombináljuk, és átmennek az analizátorba, különböző intenzitással interferálnak. A végső kép tehát nemcsak a két hullámfront által tapasztalt optikai útkülönbség függvénye (általában kritikus tényező a DIC-ben), hanem a minta által indukált két nyaláb differenciális amplitúdója is. A képekre gyakorolt ​​hatás hasonló a mikroszkóp konfigurációjához, amelyben a polarizátor és az analizátor átviteli tengelyei nem teljesen merőlegesek (valójában enyhén keresztezetlenek). Mivel a fáziskontraszt nem támaszkodik polarizált fényre, a technika nagyrészt mentes a kettős törő minták által előidézett műtermékektől.

    Az enyhén festett amplitúdójú minták, amelyek nem feltétlenül kettős törőek, de jelentős mértékben megőrizhetik a fázisgradiens karakterét, csökkent intenzitást tapasztalnak, mivel fáziskontrasztmikroszkópiában az objektív fázislemez a látható hullámhosszokat elnyeli. Ezek a minták azonban gyakran kielégítő eredményeket produkálnak a differenciális interferenciakontrasztban, ha jelentős optikai útgradiensek vannak jelen, és mindkét polarizált hullámfront egyformán elnyelődik. Valójában az intracelluláris organellumok (például ép sejtmagok és metafázisú kromoszómák) szelektív festése összekapcsolható DIC-mikroszkópos képalkotással, hogy javítsa a minták részletezését és a sejtek rögzítésének időpontjában előforduló eseményeket.

    A 7. ábrán számos példa látható a szokásos biológiai (látható fényelnyelő) kromoforokkal megfestett, fáziskontraszttal és DIC-mikroszkóppal egyaránt leképezett mintákra. A differenciális interferencia-kontrasztban megfigyelt emberi zsírral festett zsírszövet vékony metszete a 7(a) ábrán látható, és ugyanez a látómező fáziskontraszttal a 7(b) ábrán. A fáziskontraszt kép zavaró, és hiányzik a finom részletek felbontása, elsősorban a halo műtermékek miatt, amelyek elfedik a biológiai folt előnyeit. A fáziskontraszt nyilvánvalóan nem alkalmas jelentős információ lekérésére ebből a mintából. Megkülönböztetésképpen ugyanazon példány megfelelő DIC-képe (7(a) ábra) a zsírgömböket árnyékolt pszeudo-háromdimenziós domborműben jeleníti meg, ami meglehetősen jól megkülönbözteti őket a kép egyéb jellemzőitől.

    Ugyanez a hatás figyelhető meg DIC mikroszkóppal a 7(c) ábrán, ahol a béka heré vékony metszetében eltérően festődött meiotikus magok és kromoszómák nagy kontrasztban figyelhetők meg. Ez a kép előnye, hogy több foltot okosan alkalmaznak, amelyek elősegítik a genetikai anyag kromatikus elkülönítését más intracelluláris komponensektől. Valójában a minta jelentősebb információt ad, ha DIC-ben ábrázolja, mint a világosmezős megvilágítás célmegfigyelési módjában. Ugyanezt a látómezőt a fáziskontrasztban (7(d) ábra) összezavarják a sűrűn festett intracelluláris komponenseket körülvevő fényudvarok, amelyeket ebben a képalkotási módban sokkal nehezebb megkülönböztetni. Hasonló helyzet áll fenn a 7(e) és 7(f) ábrán bemutatott emlősfogak festett vékony metszeténél. A DIC-ben a zománcban lévő csíkozott lamellák dombornyomottságuk miatt könnyen megfigyelhetők (7(e) ábra), míg az optimálisnál kisebb optikai útkülönbségek, amelyek a túlfestéshez kapcsolódnak, fáziskontrasztban takarják el ezeket a struktúrákat (7(f) ábra). A 7. ábrán látható példák erős bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a differenciális interferenciakontraszt megfelelő technika enyhén festett minták megfigyelésére, még akkor is, ha ugyanazokat a mintákat nehéz fáziskontrasztban leképezni.

    A legszembetűnőbb különbség a DIC és a fáziskontraszt mikroszkóp között a differenciális interferencia-kontraszt optikai rendszerek által alkotott pszeudo háromdimenziós árnyékolt képek. A mintaképeket az elektronmikroszkópban évek óta alkalmazott árnyékolási technikákra emlékeztető módon jelenítik meg, amelyek információkat szolgáltatnak a minta topográfiai tulajdonságairól. A DIC-ben azonban a képeken látható dombokat és völgyeket nem szabad összetéveszteni a minta tényleges topográfiai profiljának jelzésével, és mindig óvatosan kell értelmezni. A fáziskontraszt nem hoz létre jelentős háromdimenziós karakterű képeket.

    A fáziskontraszt és a differenciális interferencia-kontraszt mikroszkópia közötti sok hasonlóságot és különbséget az 1. táblázat foglalja össze számos változó tekintetében, beleértve a kép fényerejét, felbontását, fáziseltolódási korlátait, műtermékeket, minta jellemzőit és költséget. Összefoglalva, a kép fényereje mind a fáziskontrasztban, mind a DIC-ben jóval kisebb (csak néhány százalékkal), mint a normál fényerejű megfigyelés, de ezek a kontrasztjavító technikák sokkal jobban definiált képeket képesek biztosítani. A megvilágítás kritikusabb a DIC-mikroszkópiánál, mint a fáziskontraszt, különösen alacsony áteresztőképességű polarizátorok használatakor nagy nagyításnál. Gyakran 100 wattos wolfram-halogén vagy higany ívkisülésű lámpára van szükség a kielégítő képalkotáshoz, míg a fáziskontraszt mikroszkópok megfelelően teljesítenek 50 wattos izzólámpákkal. Az oldalsó (x-y) és axiális (z) felbontás a differenciális interferencia-kontraszt mikroszkópiában drasztikusan meghaladja a fáziskontraszt felbontását, amely mindkét dimenzióban szerény vagy gyenge felbontást mutat, bár a fáziseltolódás észlelési határa mindkét esetben hasonló.

    A fáziskontraszt és a DIC-mikroszkópia jellemzői
    Jellegzetes Fáziskontraszt DIC
    Kép fényereje
    (Brightfield = 100 százalék)
    1,3 százalék 0,36-2,3 százalék
    Epi-fluoreszcens fényvesztés
    (Fényes mező = 0 százalék)
    28 százalék 73 százalék
    Oldalirányú felbontás Kondenzátor
    Annulus
    Korlátozott
    kiváló
    Axiális felbontás
    (Mélységi diszkrimináció)
    Szegény kiváló
    Világító rekesz 10 százaléka
    Cél NA
    Változó
    Fázis késés
    Észlelési határ
    < l /100 < l /100
    Segédprogram nagy fázisú váltásoknál Nem hasznos Hasznos
    Azimutális hatások Nem Igen
    Halos és Shade-Off Igen Nem
    Foltos minták Nem hasznos Hasznos
    Kettős törő minták Hasznos Nem hasznos
    Kettős törő minta
    Konténerek
    Igen Nem
    Brightfield kép
    Leromlás
    Enyhe Egyik sem
    Költség Mérsékelt Magas
    Asztal 1

    A nagy optikai útkülönbséggel rendelkező vastag fázisú minták könnyen leképezhetők differenciális interferencia-kontrasztban optikai metszeti technikákkal, de gyakran nehéz fáziskontraszttal leképezni őket a halo műtermékek miatt. Más tényezők, mint például az azimutális effektusok és a festett minták DIC-ben történő leképezésének képessége, segítenek ellensúlyozni a két technikát. A fáziskontraszt sokkal hasznosabb rutinszerű megfigyelésekhez szövettenyésztő laboratóriumokban, ahol az élő sejtek képalkotása műanyag tenyésztőedényekben napi tevékenység. Alternatív megoldásként a nagy felbontású információkat a legjobban differenciális interferencia-kontraszt módszerekkel lehet lekérni (gyakran time-lapse videóhoz kapcsolva) élő sejtes képalkotáshoz.Általánosságban elmondható, hogy a DIC-nek több technikai készségre van szüksége a konfigurálásához és működtetéséhez, beleértve a bonyolult igazítási folyamatot, a minta fókuszának folyamatos manipulálását, a rekesz írisz diafragma beállítását, a minta tájolását és az objektív Nomarski-prizma oldalirányú elmozdulását az optimális kontraszt eléréséhez. A fáziskontraszt mikroszkópokat sokkal könnyebb beállítani és működtetni, és viszonylag gyakorlatlan mikroszkóposok is elég hatékonyan használhatják őket.

    A fáziskontraszt általában csak gyenge kontrasztú, átlátszó fázisú minták leképezésére használható. Ezzel szemben a DIC-mikroszkópia festett és festetlen minták esetén is használható, de a kettős törő tulajdonságok észlelésekor műtermékek keletkeznek. A mintakontraszt jobb szabályozását teszi lehetővé az objektív prizma (vagy de S narmont kompenzátor) DIC-ben történő fordítása, amely számos pozícióban állítható a szürkeárnyalatos interferencia színek vagy a többszínű optikai festési effektusok különböző szintjének eléréséhez. nagy útkülönbségek. Ezenkívül a kondenzátor rekeszmembránja DIC-ben is állítható a minta kontrasztjának és felbontásának módosítása érdekében. A fáziskontraszt a kondenzátor gyűrűs membránja és az objektívben elhelyezett fázislemez által biztosított kontrasztra korlátozódik. A fáziskontraszt mikroszkóppal gyakorlatilag semmilyen kontrasztállítás nem lehetséges (a fázislemezek cseréjén kívül).

    A DIC és a fáziskontraszt összehasonlításakor számos laboratóriumban a legfontosabb szempontok közé tartozik a kiegészítő alkatrészek költsége. Mivel a DIC-hez több drága kettőstörő Nomarski prizma és feszültségmentes optikai elem (objektív és kondenzátor) szükséges, a műszerezés lényegesen drágább, mint a fáziskontraszt alkatrészek. Sok esetben, különösen amikor a fotomikrográfia és/vagy a digitális képalkotás nem elsődleges szempont, a fáziskontraszt gyakran laboratóriumi célokat szolgál. Ha azonban élő sejtekből és szövetekből vagy hasonló törékeny, átlátszó fázisú mintákból kell nagy felbontású képeket készíteni, a differenciális interferencia-kontraszt a választott technika.

    Általánosságban elmondható, hogy a fáziskontraszt és a differenciális interferencia-kontraszt mikroszkópiát kiegészítő (nem pedig versengő) technikának kell tekinteni, és együtt kell alkalmazni a minta optikai tulajdonságainak, dinamikájának és morfológiájának teljes körű vizsgálatára. Az alacsonyabb semleges sűrűségű fázislemezekkel rendelkező modern fáziskontraszt-objektívek bevezetése lehetővé teszi a mikroszkópos számára, hogy sok esetben egyetlen objektívkészletet használjon fényes tér, fluoreszcencia, fáziskontraszt és DIC képalkotáshoz.

    Douglas B. Murphy – Sejtbiológiai és Anatómiai Tanszék és Mikroszkóp, Johns Hopkins University School of Medicine, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

    Jan Hinsch – Leica Microsystems, Inc., 90 Boroline Road, Allendale, New Jersey, 07401.

    Kenneth R. Spring - tudományos tanácsadó, Lusby, Maryland, 20657.

    Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


    Elektronmikroszkópia

    A transzmissziós elektronmikroszkóp (6-1 D. ábra) képes felbontani a 0,3 nm alatti pontokat, de a gyakorlati felbontást általában korlátozza az elektronsugár által okozott próbatestek károsodása és a minták előkészítésének módszerei. Történelmileg a sejtek elektronmikroszkópos előkészítésének legelterjedtebb módja az volt, hogy a mintát vegyszerekkel rögzítették, műanyagba ágyazták, a mintát feldarabolták. vékony szakaszok, és szennyezze be a metszeteket nehézfémekkel (6-4 F ábra). Ezzel a technikával a felbontás körülbelül 3 nm-re korlátozódik, de ez elegendő ahhoz, hogy áthidalja a fénymikroszkópia és a molekuláris szerkezetek közötti szakadékot. A sejtbiológiában az elektronmikroszkópia virágkorában, 1950 és 1970 között, vékony metszetek tárták fel a legtöbb ismeretet a sejtszervecskék szerveződéséről.

    (A, JL Bowman, Kaliforniai Egyetem, Davis. C, J. Sinard, Yale Egyetem, New Haven, Connecticut. E, John Heuser jóvoltából, Washington Egyetem, St. Louis, Missouri. D–F, Don W. Fawcett, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts jóvoltából.)

    A legnagyobb felbontást szabályos mintákkal érik el, például kétdimenziós fehérjekristályokkal, amelyek gyorsan lefagynak és megtekinthetők, miközben vékony, üvegszerű (azaz amorf, nem kristályos) jégrétegbe vannak ágyazva (lásd 5-11A. ábra). Ezt nevezik krioelektronmikroszkópia mert a fagyasztott mintát tartó tárgyasztal folyékony nitrogén hőmérsékletre van lehűtve. A fagyott kristályok elektronmikroszkópos felvételei és elektrondiffrakciója bakteriorodopszin (lásd 7-8. ábra), akvaporin-vízcsatornák (lásd 10-15. ábra) és tubulin (lásd 34-4. ábra) szerkezetét állította elő 3-4 felbontással. nm. Számítógépes képfeldolgozási módszereket alkalmaznak a fehérjék háromdimenziós szerkezetének kiszámítására ezekben a szabályos mintákban. Ezek a módszerek hasonlóak azokhoz, amelyeket az elektronsűrűség-térképek röntgendiffrakciós mintákból történő kiszámításához használnak (lásd 3-10. ábra). Bár a felbontás korlátozott, és az adatgyűjtés fáradságos az elektronkrisztallográfiában, az elektronmikroszkópos képek előnye, hogy olyan fázisinformációkat tartalmaznak, amelyeket röntgendiffrakcióval gyakran nehéz megállapítani.

    Az elektronmikroszkópia értékes fehérjepolimerek és más nagyméretű makromolekuláris minták atomosnál kisebb felbontású vizsgálatához. Különféle módszereket alkalmaznak a minták előkészítésére és a kontraszt létrehozására. Az egyik módja a filamentumok vagy makromolekuláris részegységek üvegszerű jégben történő lefagyasztása, amint azt korábban leírtuk (lásd a 34-7. és 36-4A. ábrákat). A második a negatív festés, amikor a mintákat nehézfémsók vizes oldataiból szárítják (6-4 B ábra). A sűrű folthéj bevonja a részecskéket egy vékony szénréteg felületére, és körülbelül 1 nm-es felbontással képes megőrizni a szerkezeti részleteket. Alternatív megoldásként a sima felületen megszáradt makromolekulákat egy elektródáról elpárologtatott vékony fémréteggel árnyékolhatjuk (6-4 C ábra). Ennek a megközelítésnek a tartósítást javító változata a minták gyors lefagyasztása, a molekulákat körülvevő jég elpárologtatása, majd platina bevonat felvitele (lásd 30-4. és 34-11. ábra).

    Bizonyos típusú szerkezetek mikrofelvételeinek számítógépes képfeldolgozása egy molekulaszerkezet átlagos háromdimenziós rekonstrukcióját eredményezheti. A spirális szimmetriájú részecskéket, például az aktin filamentumokat (lásd 33-7. ábra) és a mikrotubulusokat (lásd a 34-5. ábrát) a dekonvolúciónak nevezett képfeldolgozó módszerrel elemezzük a háromdimenziós szerkezet rekonstruálására. Egyedi részecskéket úgy is lehet rekonstruálni, hogy először több ezer véletlenszerűen orientált részecskék képét osztályozzák a különböző nézetek szerinti kategóriákba. Ezután ebből az együttesből számítanak ki egy átlagos háromdimenziós szerkezetet. Az egyik példa a Sec61p transzlokon, amely egy riboszómához kapcsolódik (lásd a 20-6. ábrát). A közelmúltban a számítástechnika fejlődése az elektronmikroszkópos tomográfia kifejlesztéséhez vezetett, amelynek során sok képet készítenek egy viszonylag vastag mintáról különböző szögekből (a mikroszkóp belsejében lévő mintadarabok megdöntésével). A szuperponálás elmossa az egyes képeket, de ha ezeket egy háromdimenziós térképpé egyesítik, néhány nanométeres felbontással olyan összetett struktúrák is megjeleníthetők, mint a teljes sejt.

    A pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) használható vastagabb mintákon, például egész sejteken vagy szöveteken, amelyeket rögzítettek, szárítottak és vékony fémfilmmel vontak be. Itt egy elektronsugár rasztermintázatot pásztáz a minták felületén, és az egyes pontokban a felületről kibocsátott másodlagos elektronokat összegyűjtik és felhasználják a kép rekonstruálására (6-4. ábra A). A hagyományos SEM felbontása korlátozott, de ennek ellenére értékes a sejtek felszíni jellemzőinek és szövetekben fennálló háromdimenziós kapcsolatainak tanulmányozására. Azok a SEM-ek, amelyek speciális, nagy energiájú (mezőkibocsátási) ágyúkat használnak az elektronsugár előállításához, nagymértékben javították a felbontást, és ezek nagyon hasznosak voltak a sejtaljzatok, például a magpórusok tanulmányozásában (lásd 14-6B. ábra).


    Mennyire használják a fáziskontraszt és a sötétmezős mikroszkópot a biológiai kutatásokban? - Biológia

    Cikk összefoglaló:

    Mintaelőkészítés mikroszkópos vizsgálathoz

    A mikroszkópok olyan eszközök, amelyek lehetővé teszik számunkra a mikroszkopikus objektumok, például mikroorganizmusok, baktériumok, vírusok, gombák és protozoonok megfigyelését. Növényi és állati szövetek sejtszerveződésének, sejtosztódásnak vagy mitózis-meiotikus folyamatoknak a tanulmányozására használják. A mikroszkópokat olyan kóros paraméterek kimutatására használják, mint a paraziták jelenléte a vérben, a fehér- és vörösvérsejtek morfológiai jellemzői. A mikroszkópos elemzések igazságügyi és diagnosztikai jelentősége jól ismert. Ezeken a biológiai alkalmazásokon kívül a mikroszkópok hasznosak lehetnek az olyan tudományokban, mint a nanotechnológia, a fizika, a kémia, a környezetvédelem és a kohászat. A mikroszkóp nagyító ereje vagy fényből vagy elektronokból származik. A nagyítás forrásától függően a mikrobiológusok kétféle mikroszkópot használnak: fénymikroszkópot (optikai) és elektronmikroszkópot. Mind az elhalt, mind az élő sejtek megfigyelhetők, de speciális mikroszkópos technikákkal elő kell őket készíteni a mikroszkóp alatti megfigyeléshez. Lássuk a mikroszkópos minta-előkészítési technikák különböző típusait és módosításait.

    1. Fénymikroszkópos előkészítés
    :
    Különböző típusú optikai mikroszkópokat, például világos mezőt, sötét mezőt, fáziskontrasztot és fluoreszcenciát alkalmaznak különböző célokra. A mikroszkóp típusától és az alkalmazástól függően a mintát vagy tárgyat előkészítik a megfigyelésre.

    Fényes mező mikroszkóp- Ennél a típusnál a mikroszkopikus mező világosnak tűnik a sötét mintával szemben. A minta elnyeli a fényt és sötétnek tűnik. Ez elengedhetetlen a mikrobiális sejtek, különösen a baktériumok megfigyeléséhez, mivel nem nyelnek el sok fényt. A mikrobák fényelnyelő képességének növelését megfelelő színezékkel való megfestés teszi lehetővé. A festéshez háromféle festéket használnak, savas (eozin, savas fukszin), bázikus (kristályibolya, metilénkék) és semleges (savas és bázikus színezékek kombinációja). A festék felvitelét maróoldattal (jód, csersav) követi, amely oldhatatlan komplexet képez a festékkel és lerakja azt a sejtmembránba vagy a sejtfalba. A mintakeneteket hővel vagy formalinoldattal rögzítik, hogy megakadályozzák a festék vagy víz általi elmosódást. A foltos keneteket Kanada balzsam oldattal kezelve is tartósan meg lehet őrizni. Az immerziós olajokat a felbontóképesség növelésére és az objektívlencse munkatávolságának csökkentésére is használják. Festett készítményekre van szükség, mivel az élő baktériumok nem mutatnak sok szerkezeti részletet. A festés egyetlen hátránya, hogy a minták élő állapotban nem figyelhetők meg. A sejtek festése a megfigyeléshez szükséges nagyobb kontrasztot és színdifferenciálást is biztosítja. A mikroorganizmusok számára különféle típusú foltok és festési eljárások állnak rendelkezésre. Speciális festési technikákat alkalmaznak a külső morfológiai jellemzők, például alak, sejtelrendezés, sejtfal, flagella, pili, kapszula és belső struktúrák, például endospórák, citoplazmatikus szemcsék és mikrobiális sejtmag kimutatására. A színezés vagy festés olyan lépésekből áll, mint a kenet szárítása és rögzítése, majd a festékkel vagy színezékkeverékkel, maróanyaggal, színtelenítővel és az ellenfestékkel történő egymás utáni kezelés. Az egyszerű foltok, mint például a metilénkék, közvetlenül adják színüket a sejtnek. A baktériumokat általában bázikus festékekkel festik meg, mivel savas citoplazmával rendelkeznek. Egyes bakteriális tulajdonságok, például a kapszulák nem veszik fel a festéket, ezért negatívan festődnek. Ehhez a baktériumszuszpenziót nigrozin festékkel vagy India tintával összekeverjük, megkenjük és megszárítjuk. Mikroszkóp alatt a sejtek festetlen fényes testeknek tűnnek a sötét színű háttér előtt. Egyes baktériumok (spirocheták) nem festődnek meg egyszerű foltokkal, negatív festéssel figyelhetők meg. A nagyon törékeny szerkezetek, mint például a flagellák, festék impregnálással megfestődnek. Mivel nagyon vékonyak, festékoldattal kezelik, hogy lehetővé tegyék a festék lerakódását a szerkezeten. Ez foltosodást, valamint a szerkezet vastagságának növekedését eredményezi. A differenciális festési eljárások, mint például a Gram-reakció és a savgyors festés, eltérő színt adnak a különböző baktériumoknak vagy szerkezeti komponenseiknek. A Gram-festés a baktériumokat két nagy csoportra különbözteti meg: Gram-pozitív és Gram-negatív, attól függően, hogy a sejtfal összetételében különböznek egymástól. A Gram-festés nagyon fontos technika a baktériumok azonosításában és osztályozásában. Ez is egy ideális példa a baktériumok festési módszerére, ezért ebben a cikkben kötelező ismertetni. Christian Gram tudós találta fel 1884-ben. 4 lépésből áll: Az első lépés a kenet elsődleges megfestése kristályibolya oldattal. A második lépésben jódoldatot alkalmazunk maróanyagként, hogy rögzítse az elsődleges foltot a sejtfalban. Az elsődleges foltot alkohollal vagy acetonnal színtelenítik. A negyedik lépés az ellenfestés semleges vörössel vagy szafraninnal. Minden lépést meghatározott idővel hajtanak végre, majd szakaszos mosási lépések következnek desztillált vízben. A Gram-negatív baktériumok az ellenfolt színét veszik fel, míg a Gram-pozitív baktériumok megtartják a kristályibolya lila színét. Hasonlóan a baktériumokhoz, az élesztőgombákat, gombákat, aktinomikétákat, algákat, protozoákat és a baktériumok speciális csoportját, mint például a rickettsiákat, megfestik mikroszkópos vizsgálatokhoz.

    Sötét mező mikroszkóp- Ebben a mikroszkópban a minta világosnak tűnik a sötét háttér előtt, és ezt a mikroszkóp kondenzátorával érik el. A festetlen minták megfigyelésére sötéttér-mikroszkópiát használnak. A példányok élő állapotukban figyelhetők meg. Ehhez a nedves rögzítés és a függő leejtés előkészítése történik. A mikrobiális sejtszuszpenziót (cseppként és nem kenetként) zsírmentes üreges tárgylemezre helyezzük. A fedőlemezt felhelyezzük és viasszal lezárjuk, hogy elkerüljük a szuszpenziócsepp elpárolgását. Bár a morfológiai karakterek nem derülnek ki, de az egyes sejtmozgások, például a motilitás láthatók.

    Fáziskontraszt mikroszkóp - A festetlen sejtek és citológiai különbségeik megfigyelésére szolgál. Működése azon az elven alapul, hogy a megvilágítás által megváltozott fázisviszonyokat a citoplazmában lévő egyébként láthatatlan elemek idézik elő. A mikroszkóp fáziskontraszt objektívvel és speciális kondenzátorral van ellátva. Ez lehetővé teszi a sejten belüli festetlen struktúrák megkülönböztetését, amelyek törésmutatójukban csak kis mértékben különböznek egymástól. Mivel nincs szükség festésre, kémiai és morfológiai változások nem következnek be, élő vagy statikus mikrobasejtek figyelhetők meg.

    Fluoreszcens mikroszkópia- A fluoreszcencia mikroszkóp működése a fluoreszcencia jelenségén alapul. Amikor egy festék bizonyos hullámhosszú fényt nyel el, kisebb energiájú és hosszabb hullámhosszú fényt bocsát ki. A gyakorlatban a mikrobákat fluoreszcens festékekkel, például fluoreszceinnel vagy rodaminnal festik meg. A rutinszerűen alkalmazott festés a fluoreszcens antitest technika (FAT), más néven direkt immunfluoreszcens módszer. Ebben a fluoreszcens festéket mikrobasejt antitestekkel kombinálják, az ilyen jelölt antitesteket mikrobaszuszpenzióval keverik össze, és fluoreszcens mikroszkóp alatt figyelik meg. A FAT nagyon hasznos volt a patológiás diagnosztikában az olyan kórokozók azonosításában, mint a Mycobacterium tuberculosis, a Vibrio cholera, a Neisseria meningitidis, a Candida albicans, a bélsár coliformok és a streptococcusok, a pszeudomonádok, a polio és a veszettség vírusok.

    2. Elektronmikroszkópos előkészítés: Az elektronmikroszkópos technikák jelentősen eltérnek a fénymikroszkópiától. Nagyobb felbontást és nagyítást adnak rendkívül keskeny hullámhosszú elektronnyalábot használva mágneses tér jelenlétében. Az átviteli és pásztázó elektronmikroszkópok változatos alkalmazásokkal és minta-előkészítési technikákkal rendelkeznek. Néhányat itt ismertetünk.

    Pásztázó elektronmikroszkóp- A mintát elektronsugárral felületi pásztázásnak vetjük alá. A besugárzott minta alakjától és kémiai összetételétől függően másodlagos elektronokat bocsát ki. Feltárja a minta felszíni topográfiáját és 3-D szerkezetét.

    Transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM) - A mintáknak ultravékonynak kell lenniük ahhoz, hogy a TEM megfigyelje őket. Még a baktériumsejtek is nagyon vastagok az intracelluláris részletek megfigyeléséhez. Az ultravékony metszés speciális technikával történik. A baktériumsejteket műanyag blokkba ágyazzák, és ultravékony szeletekre vágják (60 nm). A metszeteket ezután urán- vagy lantánsókkal megfestik. Mivel a sejtek különböző szögekben vannak szeletelve, a szerkezeti felépítés minden részletét megkapjuk. A festetlen ultravékony metszeteket fagyasztásos repesztéssel lehet megfigyelni. Itt a mintát nem festik meg, hanem szén-másolatokat készítenek, hogy felfedjék az extracelluláris részleteket. Egy másik technikában a mintát speciális rézrácson szárítják és vákuumba helyezik. A nehézfém-platina atomjai kivetülnek és lerakódnak a próbatestre szögletes, erősen melegített izzószálból. Ezt árnyékvetésnek nevezik. Az árnyékolt kép TEM megfigyelése részleteket tár fel a minta alakjáról. A fénymikroszkópiához hasonló negatív festést, de elektronsűrű foszfotungsavat használnak festésként. A vírusok, flagellák és pilik apró részleteinek megfigyelésére szolgál.