Információ

A közvetlen RNS szekvenálás jelenlegi állapota


Nemrég megkérdezett egy kollégám, hogy lehet-e közvetlenül szekvenálni az mRNS-eket. Megtaláltam ezt a Nature újságot[1] 2009-ben a Helicos adta ki, amelyben ismertetik a térségben zajló fejlesztéseiket. Több év telt el ennek közzététele óta, de az RNAseq és a legtöbb más transzkriptomikai elemzés még mindig az RNS komplementer DNS-vé történő reverz transzkripciójával történik.

Mi az RNS szekvenálás jelenlegi állása? A Helicos nem tudta teljesíteni a technológiáját? Más platformok is megfeleltek a kihívásnak (vagy megpróbálták megtenni)? Vagy a technológia sikeresen gyártásban van, és még mindig egyszerűen beárnyékolja a hagyományos cDNS-alapú szekvenálási módszerek széles körű elterjedése?


Ozsolak F, Platt AR, Jones DR, Reifenberger JG, Sass LE, McInerney P, Thompson JF, Bowers J, Jarosz M, Milos PM. 2009. Közvetlen RNS szekvenálás. Nature, 461, 814-818, doi:10.1038/nature08390.


A Helicos 2010-2011 körül leállította a reagensek szállítását, mivel nem tudták felvenni a versenyt az Illuminával. Egyelőre úgy tűnik, hogy a fordított transzkripció -> Illumina-szekvenált cDNS sokkal olcsóbb, mint bármely más lehetőség, ez a módszer a domináns.

Az Oxford Nanopore tárgyalt a közvetlen RNS-profilozásról, de sajnos az első termékük még mindig nem került kiszállításra (DNS-re vagy másra), és még csak nem is tettek közzé adatokat, lehet, hogy egy kicsit tovább tart.


Volt egy cikk, ami most jelent meg az in situ RNS szekvenciáról, de pillanatnyilag a kapott szekvencia határa elsöprő 4 bp. Mégis, ez egy klassz technika, és ha fejlett, hasznos lehet egysejtű RNS-szekvenciákban, anélkül, hogy amplifikációra vagy könyvtár-előkészítésre lenne szükség.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23852452


MRNS szekvenálás

Az mRNA-Seq felismeri az ismert és új átiratokat, és méri a transzkriptum bőséget a pontos, átfogó elemzés érdekében

Bevezetés az mRNS szekvenálásba

Az mRNS-szekvenálás (mRNS-Seq) gyorsan a választott módszerré vált a betegségi állapotok, a biológiai folyamatok transzkriptómáinak elemzésére, és számos vizsgálati tervben. Amellett, hogy a génexpresszió mennyiségi meghatározásának rendkívül érzékeny és pontos eszköze, az mRNS-Seq azonosítani tudja mind az ismert, mind az új transzkriptum izoformákat, génfúziókat és egyéb jellemzőket, valamint allélspecifikus expressziót. Az mRNA-Seq teljes képet ad a kódoló transzkriptomról, amelyet nem korlátoz a korábbi ismeretek szűrője.

MRNS-Seq 3 egyszerű lépésben

Elemezze a kódoló transzkriptumot standard mRNS-mintákban ezzel a zökkenőmentes munkafolyamat-megoldással.

Az mRNS szekvenálás előnyei

Az mRNS-Seq számos előnnyel rendelkezik a génexpressziós tömbökhöz képest a transzkriptom elemzésében.

  • Szélesebb dinamikus tartományt kínál, lehetővé téve a génexpresszió többszörös változásainak érzékenyebb és pontosabb mérését
  • Ismert és újdonságokat egyaránt rögzít
  • A fajok széles körében alkalmazható
Átmenet a tömbökről az mRNS-Seq

Az Expression Analysis olyan eszközöket fejlesztett ki, amelyek megkönnyítik az mRNA-Seq eredmények összehasonlítását a korábbi tömbadatokkal.

Az átirat pontos, nagy felbontású nézete

Az arányos tömörítés a génexpressziós tömbök bevett technikai korlátja, amely csökkenti a dinamikatartományt, és elfedheti vagy megváltoztathatja a mért transzkripciós változásokat. 1–3 Ezzel szemben az mRNS-Seq nincs kitéve ennek a torzításnak, és átfogóbb és pontosabb méréseket biztosít a génexpressziós változásokról.

Ezenkívül az mRNS-Seq szálinformációt nyújthat, amely lehetővé teszi az antiszensz expresszió kimutatását, lehetővé teszi az átfedő transzkriptumok pontosabb mennyiségi meghatározását, és növeli az igazítható leolvasások százalékát.

Autizmus és mRNS-Seq

Stanley Lapidus, a SynapDx elnök-vezérigazgatója és alapítója arról beszél, hogy a vállalat hogyan használja az mRNA-Seq-et az autizmus tanulmányozására.

Faucibus ornare suspendisse sed nisi
Fedezze fel a NextSeq 1000 és 2000 rendszereket

A több mint 75 áttörést jelentő újítással ezek a szekvenáló rendszerek száraz műszerezést, egyszerűbb futási beállítást és gyors másodlagos elemzést kínálnak a beépített DRAGEN szoftverrel. Tapasztalja meg eddigi legegyszerűbb munkafolyamatainkat, és hajtsa végre a feltörekvő és közepes teljesítményű szekvenálási alkalmazások széles skáláját.

Javasolt mRNA-Seq munkafolyamat standard mintákhoz

Könyvtári előkészítés
Illumina Stranded mRNS Prep

Egyszerű, méretezhető, költséghatékony, gyors, egynapos megoldás a kódoló transzkriptom elemzésére, mindössze 25 ng standard (nem lebontott) RNS bemenettel.

Sorrendezés
NextSeq 1000 és amp 2000 rendszerek

Ezek a költséghatékony, felhasználóbarát, közepes áteresztőképességű asztali szekvenálók támogatják az mRNA-Seq-et, valamint számos egyéb jelenlegi és kialakulóban lévő alkalmazást.

Adatelemzés
DRAGEN RNA Pipeline

Igazítást, számszerűsítést és fúziós észlelést hajt végre.

RNA-Seq differenciális expresszió

Lehetővé teszi a differenciális génexpressziós elemzést.

Kiemelt mRNS-szekvenálási cikkek

Neurális diverzitás feltérképezése

Az Allen Institute kutatói az mRNS-Seq-et használják az egyes neuronok génexpressziójának elemzésére és a V1 idegsejtek osztályozására.

Egysejt-elemzés a fejlődésbiológiában

Dr. Colin Trapnell megvitatja laboratóriumának az egysejtű mRNS-Seq-vel kapcsolatos tapasztalatait és a bioinformatikai eszközök mindenki számára elérhetővé tételére tett erőfeszítéseit.

RNS-szekvenálási szempontok

Ismerje meg az RNA-Seq olvasási hosszára és mélységére vonatkozó követelményeket, és találjon forrásokat a kísérleti tervezéshez.

MRNS Sequencing Library Prep

Számszerűsítse a génexpressziót, azonosítsa az ismert és új izoformákat a kódoló transzkriptomban, detektálja a génfúziókat, és mérje meg az allélspecifikus expressziót továbbfejlesztett RNS-Seq könyvtár előkészítő oldatainkkal.

Átfogó mRNS-Seq munkafolyamat

Az illumina szekvenálás szintézissel (SBS) a legszélesebb körben alkalmazott NGS-technológia, amely a globális szekvenálási adatok körülbelül 90%-át állítja elő.*

Az iparágban vezető adatminőségünk mellett az Illumina integrált mRNA-Seq munkafolyamatokat kínál, amelyek leegyszerűsítik a teljes folyamatot, a könyvtár-előkészítéstől az adatelemzésig és a biológiai értelmezésig.

Illumina Stranded mRNS Prep

Egyszerű, méretezhető, költséghatékony, gyors, egynapos megoldás a kódoló transzkriptom elemzésére, mindössze 25 ng standard (nem lebontott) RNS bemenettel.

Illumina RNS Prep dúsítással

Rendkívüli befogási hatékonysággal és egyenletes lefedettséggel rendelkező célgén gyors, célzott lekérdezése.

Keresse meg a megfelelő könyvtári előkészítő készletet

Használja ezt az eszközt az Ön igényeinek legmegfelelőbb készlet kiválasztásához.

MiSeq rendszer

Gyorsaság és egyszerűség fókuszált alkalmazásokhoz, futtatásonként 1 mRNS minta szekvenálása.

NextSeq 550 rendszer

Rugalmas asztali szekvenszer, amely több alkalmazást is támogat, lehetővé téve 5–16 mRNS-minta szekvenálását egyetlen futtatás során.

NextSeq 1000 és amp 2000 rendszerek

Ezek a költséghatékony, felhasználóbarát, közepes teljesítményű asztali szekvenszerek rendkívüli rugalmasságot kínálnak az új és feltörekvő alkalmazások támogatásához.

NovaSeq 6000 rendszer

Skálázható átviteli sebesség és rugalmasság gyakorlatilag bármilyen genomhoz, szekvenálási módszerhez és projekt méretéhez.

Platform-összehasonlító eszköz

Hasonlítsa össze a szekvenálási platformokat, és határozza meg a legjobb rendszert laborja és alkalmazásai számára.

Szekvenáló reagensek

Keressen készleteket, amelyek szekvenáló reagenseket, áramlási cellákat és/vagy puffereket tartalmaznak az egyes Illumina szekvenáló rendszerekhez szabva.

DRAGEN RNA Pipeline

Igazítást, számszerűsítést és fúziós észlelést hajt végre.

RNA-Seq differenciális expresszió

Lehetővé teszi a differenciális génexpressziós elemzést.

RNA-Seq Alignment App

Igazítja az RNA-Seq olvasatokat. Számszerűsíti a génexpressziót, meghívja a kis változatokat és a génfúziókat, és bemenetet biztosít a differenciális expressziós alkalmazásokhoz.

Illumina DRAGEN Bio-IT platform

Az Illumina DRAGEN (Dynamic Read Analysis for GENomics) Bio-IT Platform az NGS adatok ultragyors másodlagos elemzését biztosítja. Számos alkalmazás áll rendelkezésre, köztük egy olyan, amely lehetővé teszi a génfúziós vizsgálatok elvégzését.

Genomatix Pathway System (GePS)

Egyetlen gént vagy génlistát társít az útvonalak, betegségek, szövetek és kis molekulák annotációs adataihoz.

IPathway útmutató

Differenciált génexpresszió, gyógyszerkölcsönhatás és betegségelemzés.

BaseSpace Sequence Hub

Az Illumina genomics számítási környezet az NGS adatok elemzéséhez és kezeléséhez.

BaseSpace Correlation Engine

Egyre bővülő, összegyűjtött genomikai adatok könyvtára, amely segíti a kutatókat a betegségmechanizmusok, a gyógyszercélpontok és a biomarkerek azonosításában.

Kapcsolódó megoldások

RNA-Seq a rákkutatásban

A génexpressziós változások mRNS-Seq segítségével történő nyomon követése segíthet a kutatóknak azonosítani a betegség prognózisát vagy a terápiára adott választ előrejelző biomarkereket. Tudjon meg többet a rákos RNA-Seq.

Génexpresszió-elemzés betegségek tanulmányozásához

Az RNS-Seq-alapú génexpresszió-profilozó vizsgálatok rávilágíthatnak arra, hogy a genetikai és környezeti tényezők hogyan járulnak hozzá a betegségek széles skálájához. Tudjon meg többet a génexpressziós profilalkotásról.

RNS gyógyszerválasz biomarker felfedezése

Ismerje meg, hogyan használhatja az RNA-Seq-et új RNS-alapú gyógyszerválasz biomarkerek azonosítására. Hozzáférés a forrásokhoz, amelyek célja, hogy segítsenek az új felhasználóknak elfogadni ezt az alkalmazást. Tudjon meg többet a gyógyszerválasz RNS biomarker elemzéséről.

Érdekel hírleveleket, esettanulmányokat és információkat kapni a szekvenálási módszerekről?

További források

Módszerek útmutató

Minden szükséges információ, a BeadChipstől a könyvtár előkészítésén át a szekvenszer kiválasztásáig és elemzéséig. Használja ezt az útmutatót a legjobb eszközök kiválasztásához laborja számára.

Egysejtű mRNS-Seq

Dr. Norma Neff arról beszél, hogy a Stanford Egyetem kutatói hogyan használják az egysejtű mRNS-Seq-et a korai fejlődés megértésére.

RNA-Seq adatelemzés

A felhasználóbarát szoftvereszközök leegyszerűsítik az RNA-Seq adatelemzést a biológusok számára, függetlenül a bioinformatikai tapasztalatoktól.

RNA-Seq génexpressziós vizsgálatokhoz

Az Illumina integrált mRNS-Seq munkafolyamatot kínál a biológia mélyebb megértéséhez.

Alacsony minőségű és FFPE minták RNA-Seq

A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott (FFPE) és más gyenge minőségű minták RNS-Seq értéke értékes betekintést nyújt a betegségkutatáshoz.

Páros végű RNS-Seq

Minden Illumina szekvenáló rendszer képes páros végű szekvenálásra, ami megkönnyíti az új RNS-transzkriptumok, génfúziók és egyebek kimutatását.

Hivatkozások
  1. Shi L, Tong W, Su Z és mtsai. Microarray szkenner kalibrációs görbék: jellemzők és következmények.BMC Bioinformatika. 20056. melléklet 2:S11.
  2. Naef F, Socci ND, Magnasco M. Az oligonukleotid tömbök pontosságának és pontosságának vizsgálata: több jel kinyerése nagy koncentrációkban.Bioinformatika. 200319:178-184.
  3. Yuen T, Wurmbach E, Pfeffer RL, Ebersole BJ, Sealfon SC. Kereskedelmi oligonukleotidok és egyedi cDNS-microarray-k pontossága és kalibrálása.Nucleic Acids Res. 200230:e48.

*Adatszámítások fájlban. Illumina, Inc., 2015

Csak kutatási célra

Nem használható diagnosztikai eljárásokban, kivéve a külön megjelölt esetekben.

Innovatív technológiák

Az Illuminánál az a célunk, hogy innovatív technológiákat alkalmazzunk a genetikai variációk és funkciók elemzésére, lehetővé téve olyan vizsgálatok elvégzését, amelyek néhány évvel ezelőtt még elképzelhetetlenek voltak. Küldetésünk kulcsfontosságú, hogy innovatív, rugalmas és méretezhető megoldásokat kínáljunk ügyfeleink igényeinek kielégítésére. Globális vállalatként, amely nagyra értékeli az együttműködési interakciókat, a megoldások gyors szállítását és a legmagasabb szintű minőséget, igyekszünk megfelelni ennek a kihívásnak. Az Illumina innovatív szekvenálási és tömbtechnológiái az élettudományi kutatás, a transzlációs és fogyasztói genomika, valamint a molekuláris diagnosztika úttörő előrelépéseit mozdítják elő.


A formalin-fixált paraffinba ágyazott elsődleges melanómák RNS-szekvenálási adatainak biológiai validálása

Az olyan kezdeményezések, mint a The Cancer Genome Atlas és az International Cancer Genome Consortium kiváló minőségű, többplatformos molekuláris adatokat állítottak elő több ezer fagyasztott tumormintából. Bár ezek a kezdeményezések felbecsülhetetlen betekintést nyújtottak a rákbiológiába, óriási potenciális erőforrások maradtak kihasználatlanok a formalinban rögzített, paraffinba ágyazott (FFPE) mintákban, amelyek könnyebben hozzáférhetőek, de technikai kihívásokat jelenthetnek a törékeny molekulák, például az RNS keresztkötései miatt. .

Kivontuk az RNS-t az FFPE primer melanómákból, és megvizsgáltuk két génexpressziós platformot – a genomszintű RNS-szekvenálást és a célzott NanoStringet –, hogy képesek-e koherens biológiai jeleket generálni. Ennek érdekében fejlesztettünk egy jobb megközelítést a génexpressziós útvonalak számszerűsítésére. Korrelációvezérelt génalkészlet segítségével finomítottuk az útvonal pontszámokat. Összehasonlításokat végzünk a The Cancer Genome Atlasszal és más nyilvánosan elérhető melanoma adatkészletekkel is.

A génexpressziós mintázatok egymással, a kialakult biológiai modulokkal, valamint a klinikai és immunhisztokémiai adatokkal való összehasonlítása megerősítette, hogy az FFPE mintákat használó mindkét platform biológiai jelei hűek az ismert biológiához. Ezen túlmenően, a betegek kimenetelére vonatkozó adatokkal való összefüggések összhangban voltak a korábbi, fagyasztott szöveteken végzett vizsgálatokkal.

A korábban nehezen hozzáférhető ráktípusokból, például kisméretű primer melanómákból származó FFPE-minták értékes és korábban kiaknázatlan analitikumforrást jelentenek az RNS-szekvenáláshoz és a NanoString platformokhoz. Ez a munka fontos lépést jelent az ilyen platformok új molekuláris alapok feltárása és a jövőbeni biológiailag vezérelt klinikai döntések meghozatala érdekében történő használata felé.

A teljes transzkriptom RNS szekvenálás (RNA-seq) drasztikusan javította a globális RNS-értékelés hűségét, felbontását és átfogóságát a génexpressziós microarray technológiához képest. Amellett, hogy jobb minőségű értékelést biztosít, különösen az alacsony expressziójú gének esetében, nem kötődik a hibridizációs megkötésekhez, ami azt jelenti, hogy a mikroRNS-ek és a nem kódoló RNS-ek, valamint a több gén izoformája, az exon-exon csomópontok és a fúziós gének is értékelhetők. Ezen túlmenően, az RNS-seq egységes méréseket biztosít a gének között, míg a hibridizációs technológia az egyes szondák egyenetlen minőségétől szenvedhet. Ezért a génexpresszió ma már pontosabban összehasonlítható gének és izoformák között. Az RNA-seq szintén kevésbé hajlamos a kötegelt hatásokra. Ezeket az előnyöket olyan nagyszabású erőfeszítésekben hasznosították, mint például a The Cancer Genome Atlas (TCGA) 1 és az International Cancer Genome Consortium 2, ahol több ezer mintát értékeltek együtt nagy biztonsággal és pontossággal.

Az RNS-seq technológia megvalósításának egyik korlátja eddig az volt, hogy a fagyasztott szövetekből előállított analitokra volt szükség. 3 A formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) minták sokkal bőségesebbek, de érzékenyebbek a nukleinsav-fragmentálódásra és az általános mintaromlásra is, így a jól megőrzött RNS kinyerése a szekvenáláshoz nehéz kihívás. 4 Ha azonban az FFPE-eredetű RNS-seq adatokat optimalizálni és szabványosítani lehetne, az exponenciálisan megnövelné a rendelkezésre álló biominták számát, és egyszerűsítené a mintafeldolgozást. Ezen túlmenően számos ráktípusnál az analízisnek csak a fagyasztott szövetekre történő korlátozása a minták torzulását eredményezheti, például sebészileg eltávolítható és/vagy terjedelmes daganatok felé, ami a szelekció által torzított mintapopulációt eredményezhet. A könnyen gyűjtött FFPE-minták használata csökkentheti a minták torzítását, és kiterjesztheti a longitudinális mintagyűjtés lehetőségét. Végül, az FFPE-minták technikailag könnyebben kezelhetők, különösen akkor, ha bizonyos érdeklődésre számot tartó területeket mikropreparálni kell a tárgylemezekről. Az elsődleges melanómák gazdagon illusztrálják ezeket a fontos elveket. A melanoma TCGA adatkészletben, amely csak fagyasztott mintákat használt, az elsődleges melanómák erősen torzultak a nagyon vastag daganatok felé (medián tumorvastagság, 11 mm), amelyek megfelelnek az American Joint Committee on Cancer T4 primer tumornak. 1,5,6 Ezzel szemben az Egyesült Államokban diagnosztizált bőrmelanómák túlnyomó többségének daganatvastagsága ≤ 4 mm, amelyek többsége ≤ 1 mm, és ezek mindegyike általában FFPE-feldolgozáson esik át diagnosztikai célokra. A daganat vastagsága a melanoma klinikai kimenetelének jól megalapozott, független előrejelzője, és a kezeléssel kapcsolatos döntéshozatal alapvető elsődleges tumorfaktora 6 ezért a vékonyabb, klinikailag relevánsabb primer melanómák hiánya a TCGA adatkészletben korlátozza a betegség teljes molekuláris megértését, optimális lehetséges transzláció a klinikára. Az FFPE minták lehetőséget kínálnak arra, hogy a daganatok minden vastagságában szerepeljenek az RNS-seq adatkészletekben, aminek megvalósíthatóságát ebben a tanulmányban bemutatjuk.

Eddig mindössze 10 tanulmány értékelte a humán FFPE daganatszövetből előállított analitákból származó transzkriptom léptékű RNS-seq technológiai megvalósíthatóságát. 7 -17 Bár ezek a vizsgálatok elvégezték az adatok technikai minőségellenőrzését, beleértve az ugyanazon mintákból származó fagyasztott és FFPE közvetlen összehasonlítását is, 7 -10,15 az a kérdés, hogy az adatok pontosan tükrözik-e a mögöttes biológiát, főként a kettő közötti nagy különbségek kimutatásán alapult. normál és daganatos szövetek 8 vagy transzkripciósan eltérő tumoraltípusok között, 8 -14,16, nyitva hagyva a hűség kérdését a daganatok közötti finomabb génexpressziós különbségek tekintetében. Ezért a jelenlegi tanulmány célja biológiailag releváns megközelítések létrehozása volt az FFPE génexpressziós adatok validálására. 38 primer melanoma minta felhasználásával több megközelítéssel megmutatjuk, hogy az RNS-seq képes érvényes génexpressziós adatokat előállítani archivált FFPE mintákból, kellő pontossággal ahhoz, hogy számszerűsítsék a daganatok közötti biológiailag releváns útvonalszintű különbségeket.

A betegeket a University of Texas MD Anderson Cancer Center Melanoma, Clinical Informatics, Tissue Resource és Translational Pathology Core adatbázisából választották ki meghatározott kritériumok szerint (Adatkiegészítés). Az így kapott kohorszt (N = 357) egy 38 betegből álló kísérleti csoportra szűkítettük. A páciensekkel kapcsolatos teljes információért lásd az Adatkiegészítést.

A High Pure miRNA Isolation Kit-et (Roche, Basel, Svájc) használtuk az RNS kivonására, a Zymo-Spin Column-t (Zymo Research, Irvine, CA) pedig a melanin eltávolítására minden mintából, melanintartalomtól függetlenül, a konzisztencia érdekében. Teljes exome szekvenálást, RNS-seq-et és két NanoString génexpressziós panelt (NanoString Technologies, Seattle, WA) végeztünk. További részletek, beleértve az RNAseq-futási mutatókat, az adatkiegészítésben találhatók.

Patológiai vizsgálatot végeztünk a daganat felszínének számszerűsítésére az RNS-kivonás előtt, és ennek segítségével megjósoltuk a szükséges számú 10 μM-os tárgylemezt, hogy az esetenként szükséges minimális mennyiségű teljes RNS-t megkapjuk. Egy online számológép a következő címen érhető el: http://odin.mdacc.tmc.edu/

Az útvonal pontszámok generálására szolgáló iteratív részhalmaz-megközelítésünk a kezdeti bemeneti génkészlet minőségétől függ. Két feltételezést tesz: a nagymértékben korreláló gének nagyrészt megosztott biológiai funkcionalitást képviselnek, és a jó minőségű bemeneti génkészletek kellően erős jelet tartalmaznak az „igazi biológiai” génektől, így a kezdeti nyers pontszám kiszámításakor (1A. ábra) a valódi biológiai jel kilépnek a zajból (1B. és 1C. ábra). Ezért a megfelelő bemeneti génkészlet kiválasztása kritikus fontosságú.Az „it.r” R programot, annak kézikönyvét, valamint további módszereket és indoklásokat az Adatkiegészítésben adtuk meg.

1. ábra: Génkészletek iteratív részhalmaza a legjobb korreláló gének azonosítására. (A) Az algoritmus vázlata. A Cancer Genome Atlas (TCGA) immungénkészletet reprezentálják. Az algoritmus leáll, amikor a végső iteráció mediánja megegyezik az előző iterációéval, így elérte a fix pontot. Ez a végső medián lesz az útvonal pontszáma. A narancssárga doboz a végső „alhalmaz” géneket jelöli, amelyek meghatározzák a pontszámot. (B) A TCGA immungénkészlet medián iterációs értékei. A 3. iteráció megegyezik a 2. iterációval, ezért nem látható. (C) A TCGA melanocita génkészlet medián iterációs értékei. (D) Végső immungénkészlet, TCGA adatok. (E) Végső melanocita génkészlet, TCGA adatok.

RNS-t vontunk ki 38 primer melanoma FFPE biopsziás mintájából, amelyeket az esetleges klinikai kimenetel alapján választottunk ki (1. táblázat). Minden mintából RNS-alikvotokat készítettünk, és az analitokat feldolgoztuk a transzkripciós léptékű RNS-szekvenáláshoz és egy egyéni immunrendszerrel dúsított NanoString platform panelhez (2A ábra adatkiegészítés).

1. táblázat: Betegbetegség jellemzők a betegség kiújulási állapota szerint rétegezve a megfelelő vizsgálati mintákra (N = 38)

2. ábra. Az RNS szekvenálás (RNA-seq) és a NanoString kedvező összehasonlításban ugyanazon mintákon. (A) A mintafeldolgozási munkafolyamat vázlata. (B) Spearman-korrelációs értékek mind az 1362 génre, amelyeken az RNA-seq és a NanoString adatkészletek osztoznak, valamint expresszió és dinamikatartomány szerint rétegezve. Az alacsony expressziójú próbákat az „alacsony expressziós” kategóriába soroltuk, még akkor is, ha alacsony dinamikatartománnyal rendelkeztek. Diák t tesztet nem átfedő kategóriákra végeztük. (*)P < .001. (C) A platformok között a legfelső erősen és gyengén korreláló gének, az RNS-seq adatok hőtérképeként bemutatva. (D) A medián abszolút eltérés osztva a mediánnal (MAD/M), az RNS-seq adatok dinamikus tartományának mérése. Minden pont egy gén, amely megfelel a (C) egyikének. Átl., átlag Korr., korreláció.

Először összehasonlítottuk az FFPE, az RNS-analitból származó RNS-seq és a NanoString adatkészleteket közvetlen, génenkénti alapon. A mindkét platformon megosztott 1362 gén közül 924 (68%) Spearman-korrelációs értéke ρ > 0,5 (2B. ábra). Kezdetben ez a platformok közötti korlátozott általános korrelációt jelezte, de úgy gondoltuk, hogy bizonyos gének úgy tűnik, hogy rosszul korrelálnak olyan okok miatt, amelyek nem kapcsolódnak a platformok közötti hűséghez. Ezért ezután azt kérdeztük, hogy milyen tulajdonságok választják el a legjobban korreláló (ρ > 0,8) és a legrosszabb korrelációjú (ρ < 0,4) géneket. Nem volt szignifikáns különbség a génhossz, a guanin-citozin tartalom vagy a kromoszóma elhelyezkedése tekintetében. Ehelyett két olyan tulajdonságot fedeztünk fel, amelyek korreláció szerint rendeződnek: az abszolút génexpressziós szintet és a dinamikus tartományt. Az alacsony abszolút expressziójú gének (n = 221 gén, az összes 16%-a) gyenge korrelációt mutattak a platformok között, ami a felbontás határának meglétére utal (2B. ábra). A dinamikus tartományhoz minden génre kiszámítottuk a medián abszolút eltérést osztva a mediánnal (MAD/M). A legjobb interplatform-korreláló gének szignifikánsan magasabb MAD/M-értékkel rendelkeztek, mint a legrosszabb interplatform korrelációs géneknek (P < .001 2C és 2D ábra). Ez azt a tényt tükrözi, hogy az alacsony varianciájú számhalmazokat a korrelációs elemzés rosszul értékeli. Az alacsony expressziójú (< 1,0 átlagos leolvasás kilobázis milliónként) és az alacsony dinamikus tartományú gének (< 0,25 MAD/M n = 251 gén, az összes 18%-a 2B. ábra) eltávolítása után a Spearman-korrelációs értékkel rendelkező gének százalékos aránya ρ > 0,5 68%-ról 84%-ra javult (746/890). Összességében az egyéni génszintű értékelés előzetesen azt sugallja, hogy az FFPE mintákon a NanoString és az RNS-seq erős egyezést mutat.

Ezután az útvonalszintű korrelációt vizsgáltuk. A hasonló funkciójú gének általában megosztják az expressziós mintákat. 18 A specifikus rokon gének közötti korreláció tehát egy adott adatkészlet biológiai hűségének mértéke lehet. Például a BUB1 és a TOP2A, mindkettő sejtciklushoz kapcsolódó gének, következetesen együtt expresszálódnak sokféle adatkészletben, beleértve a jelenlegi vizsgálat adatait is (Függelék A1. ábra). Ha ezt a gén-gén korrelációs elemzést nagyobb léptékre kiterjesztjük a korrelációs útvonalak azonosítására, a korrelációk általános erőssége felmérheti, hogy az alapul szolgáló biológiát mennyire rögzíti az adatkészlet minősége. Úgy döntöttünk, hogy a TCGA melanoma adatait referencia alapigazságként használjuk a korreláló maggének azonosításához, a rendelkezésre álló adatok magas minősége és mennyisége, valamint a TCGA pipeline magas fokú egységessége alapján. 1

Az útvonal-elemzések egyszerűsítése érdekében minden egyes útvonalhoz olyan útvonal pontszámot próbáltunk létrehozni, amely pontosan leírja annak relatív aktiválási állapotát az egyes mintákban. Ennek a megközelítésnek az egyik akadálya az, hogy a meglévő meghatározott biológiai génkészleteken belüli gének (pl. a Molecular Signatures Database [MSigDb] http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb) 19 nem feltétlenül korrelálnak egymással, ami potenciálisan vezető szerepet tölt be. zajos kottára. Úgy érveltünk, hogy az egyes génkészletekben erősen korreláló gének egy részhalmaza található, amelyek együttesen hűbben rögzítik az útvonal valódi biológiáját. Ezért kifejlesztettünk egy olyan módszert, amely ismételten iterálja a pontszám számítását a gén részhalmaza alapján, amíg a pontszám össze nem konvergál erősen kokorrelált gének egy részhalmazához. Ezt az albeállítást úgy tervezték, hogy csökkentse a zaj/jel arányt, és pontosabban tükrözze a valódi biológiai jelet. Az 1A. ábra ezt az iteratív folyamatot szemlélteti az MSigDb-ből származó GO_Immune_System_Process-el kezdődő példával, hogy létrehozzon egy immunpontszámot. A lépések részletes leírása az adatkiegészítésben található. Az 1B. és 1C. ábrák példákat mutatnak be arra, hogy a TCGA immun- és melanocita pontszámok hogyan változnak az egyes pontozási iterációk során, a végső alcsoport-génlistáik pedig az 1D. és 1E. ábrán láthatók.

A végső génalcsoport ilyen nagyfokú korrelációja egy széles útvonalon vagy sejttípuson belüli funkcionális hasonlóságot feltételez, a 407 génből álló végső immunalcsoport (a kezdeti 1984-ből) nagymértékben feldúsult ismert valódi biológiai génekkel, köztük CD3, CD8, és CD4 gének (1D. ábra adatkiegészítés). Ezen túlmenően immunpontszámunk jól egyezik az eredeti TCGA publikációban 1 (A2. ábra, függelék) leírt immunaláírással. Ezután ezt a 407 gént használtuk arany standardként, amellyel felmértük FFPE RNS-adatkészleteink azon képességét, hogy hasonló módon rögzítsék a valódi immunbiológiát. Valójában ez a 407 gén nagyfokú korrelációt őriz meg egymással az FFPE RNS-seq adatkészletünkben (A2. ábra melléklet). Egy másik megközelítést is alkalmaztunk ennek a korrelációnak a számszerűsítésére: A mintaspecifikus dinamikus tartományt a 407 gén mediánközpontú értékei között használtuk. Elméletileg bármely adott mintának meglehetősen alacsony, közepes vagy magas expressziójúnak kell lennie mind a 407 génnek, attól függően, hogy alacsony, közepes vagy magas immunsejtek jelenléte van-e. A nagy diszkordanciájú minták arra utalnak, hogy a minta hűsége csökkent. Némileg meglepő módon az FFPE-minták szignifikánsan kisebb eltérést mutattak, mint a TCGA-minták (A2. függelék), ami általánosságban magas mintaminőségre utal.

Ezután összehasonlítottuk az FFPE RNA-seq és a NanoString adatkészleteinket. Az általunk azonosított 407 alapvető immungén közül 190 mindkét platformon jelen volt, és tartalmazott olyan alapvető kanonikus immungéneket, mint pl. CD3D/E/G, CD4, CD8A/B, és CD86, ismét megtartva az erős korrelációt az egyes platformokon belül (3A. és 3B. ábra). Ezt követően a 190 gén mindegyikét külön-külön megvizsgáltuk, hogy meghatározzuk, hogy az egyes platformok mennyire képesek megragadni a valódi immunbiológiát, ahogyan az ebben a részben korábban meghatározásra került. Minden egyes gént az egyes platformokon belüli immunpontszámmal korreláltunk, és a platform eredményeit egymáshoz viszonyítottuk (3B. ábra). A gének többsége (154/190 81%) ρ > 0,5 korrelációt mutatott mindkét platformon, ami tovább nőtt (140/163 86%) az alacsony expressziójú gének eltávolítása után. Egyetlen génnek sem volt alacsony dinamikatartománya. A végső immunpontszámok közvetlen összehasonlítása erős egyezést mutatott az RNS-seq és a NanoString között (ρ = 0,91) mintánkénti alapon (3C. ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az expressziós szint ellenőrzése után mindkét platform sikeresen meg tudta ragadni a valódi pozitív immungéneket, miközben megőrizte a biológiai hűséget.

3. ábra: Útvonal szintű korrelációk a platformokon belül és a platformok között. (A) Az 1D. ábrából származó immungének hőtérképe az RNA-seq és a NanoString adatkészletekhez, az immunrendszer pontszámával a tetején. (B) Platformon belüli korreláció az egyes immungének immunpontszámával, RNS-seq-ként ábrázolva a NanoStringhez képest. Számos kulcsfontosságú immungént emelnek ki. (C-E) A (C) immun-, (D) sejtciklus és (E) bőrpontszámok korrelációja a platformok között. (F, G) Az EMT és a pigment pontszámok korrelációja (F) a TCGA primer melanomákon és (G) a jelenlegi FFPE RNS-seq adatkészleten belül. EMT, epiteliális-mezenchimális átmenet RNS-seq, RNS szekvenáló TCGA, The Cancer Genome Atlas.

Pontszámokat generáltunk további aláírásokra: sejtciklusra, bőrre, pigmentre és epiteliális-mezenchimális átmenetre (EMT a kiindulási génkészletek és a végső gén-alcsoportok listája az Adatkiegészítésben található). A pigment génkészlet tartalmazza a fő melanocita differenciálódást szabályozó MITF-et és az ismert downstream MITF effektorokat. Hasonlóan az immungénkészletre vonatkozó eredményeinkhez, magas fokú intraplatform korreláció volt (Függelék A3. ábra). Interplatform korrelációt is megfigyeltek a NanoString platformon található reprezentatív génekkel rendelkező két útvonal esetében: a sejtciklus és a bőr esetében (3D és 3E ábra). Ezen túlmenően, az öt végső útvonalon kívüli gének továbbra is erős platformok közötti korrelációt mutattak (Függelék A3. ábra). Végül összehasonlítottuk az intragénkészlet-korrelációt mind az öt útvonal esetében a primer melanómák négy adatkészletében – TCGA, a jelenlegi FFPE RNS-seq, GSE7553 és GSE15605 –, további megerősítést adva, hogy ezek a megfelelő útvonalak robusztus markerei. Függelék A4 ábra).

Ezután négy ortogonális megközelítést alkalmaztunk az FFPE RNS-seq adatok biológiai hűségének további alátámasztására. Először hierarchikus klaszterezést végeztünk adatkészletünkön 21 TCGA daganattípussal a legváltozatosabb pánrák TCGA gének felhasználásával, és kimutattuk, hogy az FFPE adatkészletünk szorosan klaszterezett mind a bőr, mind az uvealis melanomával, elsősorban a melanocita-specifikus gének magas expressziója miatt. Függelék A4 ábra). Másodszor, hierarchikus klaszterezést végeztünk az FFPE RNS-seq adatkészletünkön belül a legfelső változó gének felhasználásával, és olyan eredményeket kaptunk, amelyek szorosan megegyeznek a TCGA melanoma analízis eredményeivel 20, nevezetesen idegspecifikus, bőr- és immungénekkel dúsított klaszterek azonosítását. (Függelék A5. ábra). Harmadszor, összehasonlítottuk öt útvonal génünket három olyan génkészlettel, amelyek várhatóan nem expresszálódnak erősen melanomában. Ez az elemzés megerősítette, hogy öt útvonalunk erősen expresszálódott az FFPE RNS-seq adatkészletben, míg a három nem melanóma génkészlet nagyjából 1,0 átlagos leolvasást tett ki kilobázismilliónként. Végül megvizsgáltunk egy ismert útvonal-korrelációt öt génkészletünk között, amelyet több sejtvonal-vizsgálat is mutatott: az EMT és a pigment aláírások antikorrelálnak. 21 In vivo több stroma sejttípus expresszálja az EMT aláírást, gyengítve a korrelációt. Ennek ellenére a TCGA adatkészletben az elsődleges melanomaminták (n = 103) között az EMT és a pigment aláírások antikorreláltak (ρ = -0,47, 3F. ábra). Hasonló eredményeket figyeltünk meg az FFPE adatkészletünkben (ρ = -0,41, 3G. ábra). Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy útvonal szinten mind az FFPE-eredetű RNS-seq, mind a NanoString adatkészletek pontosan rögzítik a megállapított biológiai összefüggéseket.

Ezt követően megkérdeztük, hogy az immunhisztokémiával (IHC) igazodó aláírásaink ugyanazokon a mintákon történtek-e. Az RNS-seq sejtciklus aláírása jól korrelált a MART1/pHH3 22 IHC-vel (azaz a sejtek kétszer pozitívak a MART1-re, egy melanoma markerre és a pHH3-ra, az osztódó sejtek markereire, 4A ábra) és a megfigyelt mitotikus rátával (4B. ábra). . Ezeket a pozitív korrelációkat a NanoString adatkészletben is kimutattuk (A6. ábra melléklet). Sőt, az egyéni génexpressziós értékek a CD3 és CD8A korrelált a megfelelő IHC kvantifikációkkal. Ez a korreláció erősebb volt a pozitív festődés esetén a tumor közepén (4C. és 4D. ábra), összehasonlítva a perifériával (Függelék A6. ábra).

4. ábra: Összefüggés az útvonal pontszámai és a kórszövettan között. (A, B) Az RNS-szekvenáló sejtciklus pontszámának korrelációja az (A) pHH3 immunhisztokémiával (IHC) és a (B) mitotikus sebességgel. (C-F) Az RNS-szekvenálás CD8 vagy CD3 génexpressziós adatainak korrelációja a megfelelő IHC-vel a tumor (C, D) központjában vagy (E, F) perifériáján.

Ezt követően arra törekedtünk, hogy meghatározzuk, hogyan korrelálnak az útvonal pontszámok más klinikai adatokkal. Azt találtuk, hogy a bőr pontszáma, amely a normál epidermális géneket (pl. involukrin és keratin 1) kvantifikálja, nem korrelál a Breslow-vastagsággal és a tumor felületével (5A és 5B ábra), ami arra utal, hogy a vékonyabb és kisebb tumorbiopsziás minták valamivel nagyobbak lehetnek. a normál bőrtartalom százalékos aránya. Ezenkívül a melanocita pontszám negatívan korrelált a krónikus napkárosodás pontszámával (5C. ábra), amely a szoláris elasztózis mértékének mértéke normál bőrben, az elsődleges melanoma elváltozások mellett a hematoxilinnel és eozinnal festett szövetmetszetekben. 23

5. ábra: Összefüggés az útvonal pontszámai és a betegadatok között. (A, B) Az RNS-seq bőrpontszám korrelációja (A) Breslow vastagságával vagy (B) tumor felületével. (C) Az RNS-seq pigment pontszám antikorrelációja a krónikus napkárosodás pontszámával. (D) A génkészlet-dúsítási analízis eredménye, amely a mitotikus génkészleteket olyan betegek mintáiban gazdagítja, akiknél a betegség végül kiújult. (E) Az RNS-seq vagy a NanoString sejtciklus pontszámainak korrelációja a betegszintű kiújulási állapot szerint rétegzett mintákkal. RNS-seq, RNS szekvenálás.

Végül elfogulatlan génkészlet-dúsítási elemzést végeztünk, hogy azonosítsuk azokat az útvonalakat, amelyek korrelálnak a beteg kimenetelével. Az elsődleges melanómára vonatkozó korábbi génexpressziós vizsgálatok eredményeivel összhangban24-26 a sejtciklus génexpressziójának növekedése szignifikánsan gazdagodott azon betegek mintáiban, akiknél a melanoma végül kiújult (5D. ábra). Génkészlet-pontszámaink biológiai hűségének további alátámasztására ezután összehasonlítottuk a sejtciklus-pontszámot a kiújulásból származó primer tumorok és a kiújulás nélküli kohorszok között. Jelentős különbséget tapasztaltunk (P = 0,02) a két csoport között (5E. ábra). Ezek a beteg-orientált értékelések együttesen tovább erősítik az FFPE RNS-seq adatok biológiai hűségét.

Bizonyítékot nyújtunk arra, hogy az archív FFPE-mintákból származó, transzkriptom léptékű RNS-seq biológiailag koherens jeleket ad, amelyek jól illeszkednek a klinikopatológiai adatokhoz. Ebben a tanulmányban olyan megközelítést dolgoztunk ki az útvonal pontszámok értékelésére, amely a génlisták részhalmazait tartalmazza azáltal, hogy gazdagítja azokat a géneket, amelyek együtt funkcionálisan kapcsolódó, jól korrelált expressziós mintázatokat alkotnak. Ez a megközelítés tiszta útvonal szintű pontszámot biztosít a platformok közötti gyors összehasonlításhoz, valamint az IHC és a betegek kimenetelével kapcsolatos adatokhoz. Fontos, hogy eredményeink azt mutatják, hogy a NanoString és az RNA-seq jól korrelált adatokat generál, miután az alacsony expressziós és alacsony dinamikus tartományú géneket eltávolítják a további elemzésekből, amelyek más adatkészletekre is alkalmazhatók. A mindkét platformról nyert adatok magas minősége számos lehetőséget nyit meg. Például az elfogulatlan, teljes transzkriptom RNS-seq használata lehetővé teszi a váratlan érdeklődési utak robusztus felfedezését az archív FFPE-minták hatalmas készletének felhasználásával.

Tudomásunk szerint a mi tanulmányunk az első, amely az FFPE-eredetű RNS-seq adatokban a génexpresszió folyamatos különbségeinek biológiai hűségét értékeli, nem pedig a tumoraltípusok és/vagy a normál szövetek közötti tömeges különbségeket. 7 -17 Ez az első, amely közvetlenül összehasonlítja az FFPE-eredetű RNS-seq adatokat a NanoString adatokkal és a kvantitatív IHC eredményekkel. Fontos, hogy az útvonalszintű pontszámok nagyrészt megtartották rangsorolt ​​korrelációkat a platformok között. Klinikai környezetben alkalmazva ez a megközelítés nagyban megkönnyítheti a minták biológiailag értelmes kategorizálását. Az elsődleges melanóma esetében a sejtciklus-pontszámok segíthetnek a korai stádiumú melanómában szenvedő betegek csoportosításában azokra a betegekre, akik valószínűleg visszaesnek, vagy nem tágabb értelemben, az RNA-seq elfogulatlan természete lehetővé teszi új biomarkerek feltárását különféle körülmények között. Eredményeink azt is mutatják, hogy az FFPE RNS-seq elemzések ugyanazokat a kulcsfontosságú intergén-korrelációkat őrzik meg, mint a jó minőségű, nagy mintaszámú, TCGA fagyasztott tumor adatkészlet. Ha további adatkészletekben validálják és megfelelően alkalmazzák, eredményeink azt sugallják, hogy az FFPE RNS-seq képes azonosítani a mögöttes biológiával kapcsolatos, viszonylag finom hajtásváltozásokat.

Összességében adataink erősen alátámasztják, hogy az FFPE-eredetű RNS-expressziós adatok megbízhatóan értékelhetők a klinikailag releváns biológiai ismeretek feltárása érdekében. Az ilyen vizsgálatokat valószínűleg tovább fogja segíteni a magas színvonalú, jól kurált szövetbankok folyamatos bevezetése, amelyek klinikailag releváns betegeredmény-adatokat tartalmaznak. Javasoljuk továbbá, hogy megközelítésünk széles körben alkalmazható az útvonal pontszámok pontosabb kiszámítására, mivel a jelenlegi módszerek egy génkészlet összes génjét feldolgozzák, függetlenül a korreláció mértékétől. A jövőre nézve nagyszabású, archív FFPE RNS-seq-alapú elemzéseket képzelünk el a felfedezéshez, valamint klinikai FFPE RNS-elemzést validáláshoz és végső soron klinikai alkalmazáshoz, amely további lehetőséget kínál a génkészletek részhalmazainak alkalmazására pontszámok létrehozására és a betegek rétegzésére. biológiai és klinikai vonatkozású. A jövőben, amint az eredmények validálásra kerülnek, az következik, hogy az ilyen megközelítések bevezethetők a kortárs klinikai gyakorlatba a klinikai döntéshozatal megkönnyítése érdekében.

Részben a National Institutes of Health (NIH) Specialized Programme of Research Excellence Melanoma Grant No. P50 CA93459 támogatása a Texasi Egyetem MD Anderson Cancer Center és az NIH National Cancer Institute számára a Texasi Egyetem MD Anderson Cancer Center támogatási támogatása révén. P30CA016672 a Melanoma Research Alliance Team Science Award nagylelkű jótékonysági hozzájárulása a Texasi Egyetem MD Anderson Melanoma Moon Shots programjához, a Dr. Miriam és Sheldon G. Adelson Orvosi Kutatási Alapítványhoz, a Robert és Lynne Grossman Családi Alapítványhoz, a Michael és Patricia Booker Melanoma Kutatási Alapítványhoz Célkitűzés Melanoma a University of Texas Rising STARS Award és a Melanoma Research Alliance Young Investigator Award 508743 díja, mindkettő az LNK-nak

Koncepció és kialakítás: Lawrence N. Kwong, Lauren Haydu, Aron Y. Joon, Tiffany L. Calderone, Michael A. Davies, Alexander J. Lazar, Jeffrey E. Gershenwald

Pénzügyi támogatás: Michael A. Davies, Alexander J. Lazar, Jeffrey E. Gershenwald

Adminisztratív támogatás: Alexander J. Lazar, Jeffrey E. Gershenwald

Tananyag vagy betegek biztosítása: Lawrence N. Kwong, Michael T. Tetzlaff, Man Kam Kwong, Alexander J. Lazar, Jeffrey E. Gershenwald

Adatgyűjtés és -gyűjtés: Lawrence N.Kwong, Mariana Petaccia De Macedo, Lauren Haydu, Aron Y. Joon, Michael T. Tetzlaff, Tiffany L. Calderone, Chiang-Jun Wu, Michael A. Davies, Alexander J. Lazar, Jeffrey E. Gershenwald

Adatelemzés és értelmezés: Lawrence N. Kwong, Lauren Haydu, Aron Y. Joon, Michael T. Tetzlaff, Chiang-Jun Wu, Man Kam Kwong, Jason Roszik, Kenneth Hess, Michael A. Davies, Alexander J. Lazar, Jeffrey E. Gershenwald

Kéziratírás: Minden szerző

A kézirat végleges jóváhagyása: Minden szerző

Az alábbiak a jelen kézirat szerzői által biztosított közzétételi információkat mutatják be. Minden kapcsolat kompenzáltnak minősül. A kapcsolatok önállóak, hacsak nincs megjelölve. I = Közvetlen családtag, Inst = Intézményem. A kapcsolatok nem kapcsolódhatnak a kézirat tárgyához. Az ASCO összeférhetetlenségi politikájával kapcsolatos további információkért látogasson el a www.asco.org/rwc vagy az ascopubs.org/po/author-center oldalra.

Részvény és egyéb tulajdonosi érdekeltségek: Sarepta Therapeutics

Kutatási finanszírozás: Array BioPharma

Nincs feltárandó kapcsolat

Nincs feltárandó kapcsolat

Nincs feltárandó kapcsolat

Tanácsadói vagy tanácsadói szerepkör: Myriad Genetics, Novartis

Nincs feltárandó kapcsolat

Nincs feltárandó kapcsolat

Nincs feltárandó kapcsolat

Nincs feltárandó kapcsolat

Nincs feltárandó kapcsolat

Tanácsadói vagy tanácsadói szerepkör: GlaxoSmithKline, Roche, Novartis, Sanofi, Vaccinex, Bristol-Myers Squibb, Syndax, NanoString Technologies

Kutatási finanszírozás: GlaxoSmithKline (Inst), Roche (Inst), AstraZeneca (Inst), Merck (Inst), Oncothyreon (Inst), Myriad Genetics (Inst), Sanofi

Foglalkoztatás: GE Healthcare (I)

Vezetés: Beta Cat Pharmaceuticals, Archer Biosciences

Részvény és egyéb tulajdonosi érdekeltségek: Archer Biosciences, Beta Cat Pharmaceuticals

Honorárium: Novartis, Bristol-Myers Squibb, Janssen Oncology, Roche

Tanácsadói vagy tanácsadói szerepkör: Novartis, Illumina, GE Healthcare

Kutatási finanszírozás: MedImmune, AstraZeneca, Roche, Novartis

Szabadalmak, jogdíjak, egyéb szellemi tulajdon: Elsevier

Utazás, szállás, költségek: Bristol-Myers Squibb, Novartis

Tanácsadói vagy tanácsadói szerepkör: Castle Biosciences, Merck

Szabadalmak, jogdíjak, egyéb szellemi tulajdon: Mercator Therapeutics

A1. ábra. Példa a megőrzött gén-gén korrelációra az adatkészletek között. A TOP2A és a BUB1 korrelációja a The Cancer Genome Atlasban, a GSE19234-ben, a GSE22155-ben és a jelenlegi formalin-fixált paraffinba ágyazott szöveti adatkészletekben, amelyek mindegyike a betegek melanóma mintáit értékeli.

A2. ábra. Az immungénkészlet további validálása. (A) A The Cancer Genome Atlas (TCGA)-eredetű immunpontszám és a hivatalos TCGA immunpontszám összefüggése. (B) Venn diagram, amely szemlélteti a TCGA-eredetű immungénkészletünk és a hivatalos TCGA immungénkészletünk közötti géntagság átfedését. (C) Felül: A 38 formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) RNS-seq adatkészlet hőtérképe mind a 407 TCGA-eredetű immungénkészlet-génhez. Alul: A medián abszolút eltérés osztva a mediánnal (MAD/M) minden minta esetében mind a 407 immungén esetében, az immunrendszeren belüli korrelatív eltérés mértéke. (D) Az immun MAD/M összehasonlítása a TCGA és FFPE adatkészletekhez.

A3. ábra. Hőtérképek, amelyek a végső fixpontos génkészleteket mutatják az (A) epiteliális-mezenchimális átmenethez (EMT), (B) sejtciklushoz és (C) a bőrhöz az RNS-szekvenáláshoz (RNS-seq) és a NanoStringhez. Minden génkészlet esetében az RNS-seq és a NanoString minták azonos sorrendűek, a legmagasabbtól a legalacsonyabb RNS-seq pontszámig. A melanocita pontszám gének nem állnak rendelkezésre a NanoString számára, mert nem voltak jelen melanocita gének a panelen. (D) Formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) NanoString versus FFPE RNS-seq korrelációk, az öt útvonal végső géntagjainak összehasonlítása a két platform között megosztott összes többi génnel.

A4. ábra. Intragén-készlet korrelációk az öt útvonalra. A génkészlet minden tagja korrelál a megfelelő általános génkészlet pontszámával, az elsődleges melanómák esetében csak az (A) The Cancer Genome Atlas (TCGA) és a jelenlegi formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) RNS-szekvenciákban és (B) GSE7553 és GSE15605 adatkészletek. A tetején látható százalékok az FFPE szövetben lévő gének ρ > 0,5 értékét jelzik. (C) A 697 legváltozatosabb pánrákgén hierarchikus klasztere 21 ráktípusra, valamint az FFPE melanoma adatkészletünkre. Az árnyékolt háromszögek kiemelik a klasztereket. A sárga doboz a melanoma-mintákban gazdag melanocita-specifikus géneket jelöli, és olyan géneket tartalmaz, mint pl. TYR, TYRP1, és MLANA. ACC, mellékvesekéreg carcinoma BLCA, húgyhólyag carcinoma BRCA, mell carcinoma COADREAD, colorectalis adenocarcinoma EMT, epithelialis-mesenchymális átmenet FFP, ez a tanulmány GBM: glioblastoma multiforme HNSC, fej és nyak laphámsu carcinoma LIHC, hepatocelluláris carcinoma KIRCcin, hepatocelluláris karcinóma, KIRCcin vesepapilláris karcinóma LAML, akut myeloid leukémia LGG, alacsony fokú glióma LUAD, tüdő adenokarcinóma LUSC, tüdő laphámrák Mets, metasztázisok MESO, mesothelioma PAAD, hasnyálmirigy adenocarcinoma PRAD, prosztata adenocarcinoma OV, metasticus pristaticus SKCM bőr melanoma THCA, pajzsmirigy karcinóma UCEC, méh karcinóma UVM, uvealis melanoma.

A5. ábra. (A) A legváltozatosabb gének felső 5%-ának hierarchikus klaszterezése. A dúsított génosztályokat három klaszterre mutatjuk be a Metacore elemzések alapján. A végső klaszter nem gazdagodott egyértelműen. Megjegyezzük, hogy a MITF/melanocita útvonalat nem sikerült helyreállítani a kisebb adatkészlet miatt (itt n = 38 minta v n = 333 a TCGA-ban) és a melanociták génexpressziójának kisebb variabilitása, ami azt eredményezi, hogy ezek a gének nem tartoznak a legjobb 5% közé. (B) Átlagos leolvasások kilobázismillióra (RPKM) az összes génre a jelen vizsgálatban használt öt génkészleten belül, és három génkészlet esetében, amelyek várhatóan nem expresszálódnak erősen melanomában. A tetején lévő százalékok azt jelzik, hogy az egyes génekben az 1,0-es átlagos RPKM-küszöb feletti gének százalékos aránya (szaggatott vonal). A három kontrollgénkészletet a GTEx normálszöveti adatbázisából származtattuk. A hibasávok a medián plusz interkvartilis tartományra vonatkoznak. Az y-tengely léptéke log10.

A6. ábra. Összefüggés az útvonal pontszámai és a NanoString adatok hisztopatológiája között. (A, B) A NanoString sejtciklus pontszámának korrelációja (A) pHH3 immunhisztokémiával (IHC) és (B) mitotikus sebességgel. (C-F) A NanoString CD8 vagy CD3 gén expressziós adatainak korrelációja a megfelelő IHC-vel a tumor (C, D) központjában vagy (E, F) perifériáján.


Projektek diplomás rotációknak és rendkívül motivált egyetemistáknak

Projektjeink hozzájárulnak a Human Cell Atlas (HCA), a Human BioMolecular Altas (HuBMAP), a 4D Nucleome (4DN) programhoz, a cukorbetegség kutatásához és az Alzheimer-kutatáshoz.

Térbeli transzkriptomika rendkívül nagy térbeli felbontással

A térbeli transzkriptomikai módszerek lehetővé teszik az RNS szekvenálását emberi szövetből, miközben regisztrálják minden szekvenált RNS térbeli helyét az eredeti szövetben. Ez a projekt olyan következő generációs térbeli transzkriptomikai eszközöket fejleszt ki, amelyek jelentősen javítják a térbeli felbontást és az elemezhető szövet méretét. Rendkívül nagy felbontású, nagy sűrűségű, nagy pontosságú és reprodukálható térbeli leképezési diákat (HiFi slides) fogunk fejleszteni a térbeli transzkriptom elemzéséhez.

A fehérje-fehérje kölcsönhatások feltárása genomi skálán

A protein-protein interakciók (PPI) genom léptékű feltérképezése továbbra is munkaigényes és erőforrás-igényes. Ez a projekt egy rendkívül nagy áteresztőképességű genomi alapú technológiát fejleszt ki az emberi PPI-hálózat genomiális léptékű feltérképezésére. Ez a genomtechnológia és a hozzá kapcsolt genomiális informatikai eszközök a humán PPI-hálózat referenciatérképét fogják generálni.

Gyógyszer-fehérje kölcsönhatások feltárása egy gyógyszerkönyvtár és az összes emberi fehérje között egyetlen kísérlettel

Ez a projekt olyan genomikai technológiát fog kifejleszteni, amely képes feltárni az összes gyógyszer-fehérje kölcsönhatást egy kis molekula-könyvtár és egy fehérjekönyvtár között. Ez a technológia várhatóan a hatékonyság 1000-szeresével fogja átalakítani a gyógyszerszűrés azonosításának jelenlegi gyakorlatát.

RNS-kromatin kölcsönhatások feltárása egyetlen sejtben

Ez a projekt olyan technológiákat fejleszt ki, amelyek képesek feltárni az RNS-kromatin kölcsönhatásokat egyetlen sejtben.

Az egész genomra kiterjedő RNS-kromatin kölcsönhatások és a 3D genom szerveződés közötti kapcsolat

Továbbra sem világos, hogy a kromatinhoz kapcsolódó RNS-ek milyen mértékben tükrözhetik a genom 3D-s szerveződését. Ebből a célból az iMARGI-t (szekvenálási technológia) alkalmaztuk a genom-szerte fellépő RNS-kromatin kölcsönhatások feltérképezésére humán embrionális őssejtekben, fitymasejtekben és leukémia sejtekben. Ez a projekt összehasonlítja ezeket az iMARGI adatokat a genom interakciós adatokkal, beleértve a Hi-C-t és a PLAC-seq-et három különböző skálán. A kompartment skálán megvizsgáljuk, hogy az A kompartment kromatin nagy mennyiségű RNS-hez kapcsolódik-e, beleértve az intrakromoszómális és interkromoszómális RNS-kromatin kölcsönhatásokat. A TAD skálán megvizsgáljuk, hogy szinte az összes RNS-kromatin kölcsönhatás RNS végei egy vagy néhány egymást követő TAD határain belül vannak-e. A hurokskálán megvizsgáljuk, hogy az RNS-kromatin kölcsönhatások feldúsultak-e a PLAC-seq eredetű enhanszer-promoter kölcsönhatásokkal.


Az RNS-SEQ MINT A PRECÍZIÓS NEUROONKOLÓGIA ÖSSZETEVŐJE

Az agresszív agydaganatok esetében a citotoxikus kemoterápia és a sugárkezelés optimalizálására tett kísérletek nem javították a szomorú prognózist. A precíziós neuro-onkológiai programok elkezdődtek az NGS-technológiák használatával, hogy azonosítsák azokat az onkogén molekuláris elváltozásokat, amelyek racionálisan megtervezett inhibitorokkal célozhatók. Az RNA-seq egyedülálló előnye a precíziós orvoslás kontextusában, hogy képes kimutatni az expresszált fúziós géneket, amelyek gyakran onkogén okozói agyrákban.(22) Például az RNS-seq-t használták a FGFR3-TACC3 fúziós gént a felnőtt GBM 3,1%-ában (1. ábra). Az FGFR3-TACC3 konstitutív kinázaktivitásra tesz szert, ami invazív, gyorsan növekvő, magas fokú gliomát okoz.(76) A kis molekulájú FGFR3-inhibitorok meghosszabbítják az FGFR3-TACC3 által vezérelt intrakraniális gliómákat hordozó egerek túlélését.(76) FGFR-inhibitor könyörületes használata két GBM-ben. A betegek ígéretes eredményeket mutattak, ami alátámasztotta az ilyen gyógyszerek további klinikai vizsgálatát FGFR-TACC-pozitív betegekben.(86)

Egy másik példaként az RNS-seq értékes volt az olyan génfúziók jellemzésében, amelyekben a TALÁLKOZOTT onkogén, amelyek a gyermekkori GBM 10%-ában, valamint a felnőttkori másodlagos GBM 15%-ában találhatók meg, ahol rossz prognózissal járnak (1. ábra). (10, 87) A MET-gátlók, mint a krizotinib, ígéretes terápiák a betegségek kezelésére. GBM-ek rejtekhelye TALÁLKOZOTT fúziók vagy amplifikációk. (87) Mint fentebb tárgyaltuk, az RNS-seq azonosítására is használható C11orf95RELA fúziók, amelyek az onkogén NF-㮫 jelátvitelt irányítják a szupratentoriális ependimomák több mint kétharmadában (38) PVT1-MYC fúziók medulloblasztómában,(39) és TTIH1-C19MC fúziók embrionális daganatokban többrétegű rozettákkal (88), amelyek mindegyike fontos diagnosztikai és prognosztikai információkat hordoz.

Klinikai vizsgálatok azt sugallják, hogy a precíziós onkológiai megközelítések drámaian javíthatják a rákos betegek kimenetelét. 570, 32 149 rákos beteg bevonásával készült, II. fázisú vizsgálat metaanalízise azt mutatta, hogy a precíziós kezelési stratégiában részesülőknél szignifikánsan magasabb volt a medián válaszarány (31% versus 10,5%) és medián progressziómentes túlélés (5,9 versus 2,7 hónap) a standardhoz képest. kezelés.(89) Ez a tanulmány nagyon konzervatívan határozta meg a precíziós terápiát, beleértve az egyetlen biomarkeren alapuló kezeléseket is.(89) Az átfogó szekvenálási adatok beépítése a precíziós orvosi programokba tovább javíthatja az eredményeket.

Az úttörő precíziós orvosi programok, mint például az INFORM (Németország) és a MiOncoSeq (University of Michigan), az RNS-seq-et használták a fúziók, szerkezeti változatok és génexpressziós változások szűrésére, amelyek diagnosztikai és terápiás vonatkozásúak.(22, 90, 91) Egy kísérleti INFORM vizsgálatban gyermekkori daganatok sorozatát elemezték teljes exome, alacsony lefedettségű teljes genom és RNS szekvenálás, valamint metilációs és expressziós microarray segítségével. 52 betegből 26 (50%) mutatott potenciálisan megcélozható elváltozást, és tíz betegnél az orvos úgy döntött, hogy megfelelő célzott terápiát alkalmaznak, és néhány olyan daganatnál is megfigyeltek olyan válaszokat, amelyek nem reagáltak a hagyományos kezelésekre.(90) Csoportunk nemrégiben páros kezelést alkalmazott. csíravonal és tumor DNS és RNS szekvenálás 50 magas kockázatú agydaganatban szenvedő gyermeknél és fiatal felnőttnél a MiOncoSeq programon keresztül, és nagy megvalósíthatóságot és alkalmazhatóságot talált, különösen glia agydaganatokban (kéziirat előkészítés alatt).

Ezek az úttörő precíziós onkológiai vizsgálatok gyakran több célpontot azonosítottak betegenként, ami arra utal, hogy a kombinált terápiák optimalizálhatják a választ a jövőbeni vizsgálatok során. (22, 90) Eredményeik arra is utaltak, hogy a klinikai szekvenálás nemcsak a kezelési célok azonosítására, hanem a genetikai változatok jellemzésére is használható. amelyek befolyásolhatják a jelölt gyógyszerek felszívódását, eloszlását, metabolizmusát és kiürülését (ADME).(90) Végül ezek a vizsgálatok olyan területeket tártak fel, amelyekben a jövőben javítani kell, mint például a vártnál hosszabb szekvenálási idők, amelyek késleltették a klinikai hatást, és az FDA-hiány. jóváhagyott szerek gyermekgyógyászati ​​betegek számára.(22)

A rosszindulatú agydaganatok precíziós onkológián alapuló megközelítésével kapcsolatos egyik szempont az intratumorális heterogenitásuk, ami aggodalomra ad okot, hogy egy biopsziás minta esetleg nem rögzíti a daganat más régióiban található molekuláris elváltozásokat. (79) A GBM-en belüli heterogenitáson túlmenően. daganat, a visszatérő gliomák jelentős genetikai eltérést mutatnak a kezdeti daganattól, ami nem magyarázható az eredeti daganat heterogenitásával.(92) Ezért gondos biopszia-tervezésre lesz szükség, a visszatérő rosszindulatú agydaganatok újrabiopsziájával és profilozásával. az optimális válaszok érdekében.(92)


Normalizálás

Az egyes sejtekből származó mRNS befogása a mintákon belül és a minták között változik, ezért az adatok normalizálása segít ennek a torzításnak a leküzdésében. Az olyan módszerek, mint a Scanpy58, Seurat6 és CellRanger, ugyanazt a globális könyvtár normalizálási módszert alkalmazzák. Ez a módszer először minden cellát megszoroz egy 10e 4 léptéktényezővel és a természetes log transzformáció minden értéket. Ez segít a nagy értékek felé torzító adatok kezelésében, és nem csökkenti a kis értékeket. Egyes módszerek az adatokat egységvarianciára, átlagértékre és legfeljebb 10-es szórásra skálázzák, megakadályozva bizonyos gének túlzott dominanciáját. A biológiai kovariánsok, például a sejtciklus-hatások, a mitokondriális gének és a számlálási mélység visszafejlésének gyakorlata még mindig vita tárgyát képezi, hogy ezek hasznosak-e vagy sem, mivel ezek a tényezők biológiai folyamatokat képviselhetnek. Mivel nem értünk minden biológiai folyamatot, egy vagy két biológiai technikai tényező visszafejlődése fokozhatja vagy elfedheti a többit.

A normalizálást követően az scRNA-seq adatkészletekkel kapcsolatos gyakori probléma a kötegelt effektusok. Itt lehet megjeleníteni az scRNA-seq adatkészletek közötti eltéréseket a külön tételekben készített minták alapján. Ez gyakori lehet a rákmintákban, mivel a különböző betegek, szövettípusok és kezelési körülmények köteghatáshoz vezethetnek. Néhány algoritmust, mint például a ComBat, fejlesztettek ki e hatások korrigálására7. Azonban a legnépszerűbb algoritmusok scRNA-seq kötegelt korrekció a Harmony24, LIGER57 és Seurat 347, mivel kimutatták, hogy a legtöbb adatkészletben felülmúlja a meglévő kötegelt korrekciós módszereket53. Jelenleg a Cell Ranger 3.0 by 10X Genomics is megvalósította a közös legközelebbi szomszédok (MNN) algoritmussal18, hogy korrigálja a különböző kémiákat. Egyes esetekben, amikor a tételek szélesebb körben különböznek egymástól, például a különböző szövettípusúak vagy eltérő kémiai összetételűek, előfordulhat, hogy az MNN kötegkorrekciója nem elegendő. Így az olyan integrációs módszerek, mint a Seurat47, LIGER57, Harmony24 és BBKNN (Polanski et al., 2020), felhasználhatók a kötegelt hatások korrigálására, lehetővé téve az scRNA-seq adatkészletek jobb integrációját.


A közvetlen RNS-szekvenálás jelenlegi állapota - Biológia

az Élettudományok Analitikai Kémiai Állami Kulcslaboratóriuma, Nanjing Egyetem, Nanjing, Kína

b Együttműködési Innovációs Központ Kémiai Élettudományokért, Nanjing Egyetem, Nanjing, Kína

c Kémiai és Vegyészmérnöki Iskola, Nanjing Egyetem, Nanjing, Kína
Email: [email protected]

d Orvosbiológiai Mérnöki Tanszék, Műszaki és Alkalmazott Tudományok Főiskola, Nanjing Egyetem, Nanjing, Kína
Email: [email protected]

Absztrakt

A 2'-dezoxi-2'-fluor-arabinonukleinsavat (FANA), amely a xeno-nukleinsav (XNA) egyik típusa, intenzíven tanulmányozták a molekuláris gyógyászatban és a szintetikus biológiában, kiváló géncsendesítő és katalitikus hatása miatt. Bár sürgősen szükséges, a FANA-t nem lehet közvetlenül szekvenálni egyetlen meglévő platformon sem. A nanopórusos szekvenálás, amely egyetlen molekula analitot azonosít közvetlenül annak fizikai és kémiai tulajdonságai alapján, ígéretesnek tűnik a közvetlen XNA szekvenálásra. A koncepció bizonyítékaként a különböző FANA homopolimerek jól megkülönböztethető póruselzáró jeleket mutatnak egy Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopórusban. A FANA-nak egy DNS-meghajtó szálhoz való ligálásával a közvetlen FANA-szekvenálást phi29 DNS-polimeráz segítségével a Nanopore-induced Phase Shift Sequencing (NIPSS) segítségével mutatták ki. Amikor egy FANA-templáthoz kötődik, a phi29 DNS-polimeráz váratlan reverz transzkriptáz aktivitást mutat, ha egyetlen molekula vizsgálati eljárásban figyelik. Az együttes további vizsgálatait követően a phi29 DNS-polimeráz a FANA korábban ismeretlen reverz transzkriptáza, amely szobahőmérsékleten működik, és potenciálisan ideális a nanopórusos szekvenáláshoz. Ezek az eredmények a cukorral módosított XNS első közvetlen szekvenálását jelentik, és arra utalnak, hogy a phi29 DNS polimeráz ígéretes enzimként működhet számos XNS tartós szekvenálásában.


Számítási erőforrások

Nagy teljesítményű számítástechnikai (HPC) fürt: A másodlagos és harmadlagos adatok elemzéséhez egy központi nagy teljesítményű számítástechnikai (HPC) létesítmény áll rendelkezésre 1,5 petabájtos tárolókapacitással, &ldquoMinerva&rdquo néven. A Minerva-fürt 120 darab Dell C6145 kétlapátos házból áll, összesen 7680 magból (csomópontonként 64 magból), 70 teraflop csúcssebességgel, négy adatátviteli sebességű (QDR, 40 Gbps) InfiniBand hálózaton keresztül összekapcsolva. Minden számítási csomópont legalább 256 GB memóriával van felszerelve, egy 1 TB-os nagy memóriával rendelkező csomóponttal. Az elemzéshez elérhető hardver CPU-hoz kötött párhuzamos jobokra van optimalizálva, mint például az NGS olvasási leképezés, valamint a párhuzamos jobokra, például a Bayes-féle hálózati rekonstrukcióra, amelyek memóriakötöttek. Ezenkívül a nagy sebességű InfiniBand összekapcsolások lehetővé teszik a jelentős megosztott memóriát igénylő feladatokat, például a splice-forma-specifikus RNAseq eredmények összehasonlítását az izoforma-specifikus ko-expressziós hálózatok létrehozásához. A Minerva kettős 10 GB-os Ethernet kapcsolaton keresztül kapcsolódik a Genomics Core klaszterhez és a Mount Sinai hálózathoz. GridFTP-képes csomópontok is rendelkezésre állnak a gyors adatátvitelhez külső oldalakra.Az ISMMS számítási erőforrásaihoz való hozzáférést tűzfalak korlátozzák, a külső hozzáférést pedig biztonságos shell/ftp biztosítja kétfaktoros hitelesítéssel.

A Minerva által kínált szoftverek és programozási környezetek a legjobbak, és olyan közösségi szabványokat tartalmaznak, mint a Linux és az MPI. A fürt erőforrás-menedzsereket és ütemezőket futtat, hogy kiegyensúlyozza a munkaterhelést, és a lehető legtöbb feladat feldolgozására van optimalizálva a legmagasabb általános gépkihasználtság, munkateljesítmény és munka sikerességi aránya érdekében. A Minerva több mint 95%-os üzemidővel működik, méretezhető és reprodukálható konfigurációkezelési technikákat használva. A hosszú távú archiválást a nagy kapacitású Tivoli Storage Manager (TSM) rendszer biztosítja, és védelmet nyújt az adatvesztés ellen. A szalagok egy példányát a helyszínen kívül tartják (New Jersey), egy pedig a helyszínen marad a Sínai-hegyen. A szalagokon lévő összes adat titkosítva van. A Sinai politikának megfelelően a szalagokat legalább hat évig megőrzik.

A Minerva fájlrendszer kiterjedt adatkapacitást (összesen körülbelül 14 PB tárhelyet) biztosít a kutatási adatok nagy teljesítményű tárolására és elérésére, az IBM Spectrum Scale (korábbi nevén GPFS) alapján. A Minerva fájlrendszer különböző tárolószintekből áll, hogy biztosítsa a felhasználók számára a maximális teljesítmény előnyeit, és körülbelül 600 csomópontra van felszerelve, beleértve a 264 TB-os flash-készletet. A Technológiai Fejlesztési Laboratórium 670 TB-os dedikált allokációval rendelkezik különböző párhuzamos projektekre.

Egysejt-elemzés

Kapcsolattartó: Kristin Beaumont, PhD: egyetemi adjunktus és az egysejt genomikus technológia fejlesztésének igazgatóhelyettese ([email protected])

Az online benyújtási űrlap linkjét a projekt részleteinek véglegesítésekor biztosítjuk. Ezt a benyújtási űrlapot a minta benyújtása előtt kell benyújtani. A minták leadása 10:00 és 15:00 között (a CITESeq esetében 14:00) az Icahn 13-76.

Szabványos és egyedi egysejtű és térbeli transzkriptomikai elemzési megközelítések széles skáláját kínáljuk, amelyeket a következő technológiához való hozzáférésre terveztek:

Mintaelőkészítés az egysejt-elemzéshez:

  • Miltenyi GentleMACS Octodiszociátor a szövetek egysejt-szuszpenzióvá történő disszociációjához
  • Levitas LeviCell válogatórendszer (várhatóan 2021 áprilisában) élő sejtek/magok dúsítására az egysejt elemzés előtt

Egysejt/nukleusz elemzés:

  • 10X Genomics Chromium rendszer a nagy áteresztőképességű 3&rsquo/5&rsquo RNS-hez Több ezer-tízezer egyedi sejt vagy sejtmag szekvenálása szubpopuláció azonosításhoz és expressziós elemzésekhez. Minden immunprofil-készítést, CITESeq, ATACSeq, multiome RNA/ATACSeq és további fejlesztésen alapuló egysejtes vizsgálatokat kínálunk ezen eszközök segítségével.

Beviteli követelmények: Legalább 500 000 sejt törmelékmentes szuszpenziója (>80% életképesség) az scRNASeq és scATACSeq esetében, és legalább 1e6 sejt (>80% életképesség) a CITESeq esetében. A szuszpenziónak 1e6 sejt/ml koncentrációjúnak kell lennie PBS + 0,04% BSA-ban.

  • CellSee egycellás platform közepes és nagy áteresztőképességű cellakiválasztáshoz és egyedi módszerek fejlesztési alkalmazásokhoz. A beviteli követelmények kísérletenként változnak, a részletekért forduljon hozzánk.
  • MissionBio Tapestri platform kereskedelmi és egyedi célzott amplikon DNS-szekvenáláshoz egyetlen sejt szinten. A beviteli követelmények kísérletenként változnak, a részletekért forduljon hozzánk.
  • Berkeley Lights Beacon akár 3500 egysejt (vagy sejtcsoport) izolálására egysejtű vagy alacsony bevitelű valós idejű sejtbiológiához, különféle molekuláris csővezetékekkel kombinálva a kiválasztott egysejtek jellemzésére. A beviteli követelmények kísérletenként változnak, a részletekért forduljon hozzánk.
  • Fluidigm C1 legfeljebb 96 egysejt izolálására, majd egysejt-szekvenálási célokra, különféle molekuláris csővezetékekkel kombinálva az egysejtű RNS és DNS amplifikálására.
  • 10x Genomics Visium: Minősített szolgáltató vagyunk ehhez a vizsgálathoz, amelyet legfeljebb 6,5 mm x 6,5 mm méretű szövetek térbeli transzkriptomikus profilozására használnak.

Beviteli követelmények: 6,5 mm x 6,5 mm-nél nem nagyobb OCT blokkban elhelyezett frissen fagyasztott szövet

Mikrotömbök

Az Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology és a Genetikai és Genomikai Tudományok Osztálya jelentős beruházásokat hajtott végre a nagy áteresztőképességű feldolgozó berendezésekbe a nagy BeadArray projektekhez. Két TECAN Evo folyadékkezelő robotot üzemeltetünk, amelyek futásonként 24 chip feldolgozására képesek. Illumina HiScan microarray szkennerünk egy csúcskategóriás rendszer robotkarral, amely 24 órás microarray adatgyűjtést tesz lehetővé. A meglévő berendezésekkel és létesítményekkel a genomika mag hetente akár 600 mintát is képes feldolgozni.

Ha mintákat szeretne beküldeni a BeadArray elemzéshez, kérjük, tekintse meg a minták benyújtási oldalát a helyszínről és az árakról. A kísérleti tervezéshez útmutató is rendelkezésre áll.

A Microarray-ről

A DNS-mikroarray jól bevált technológia a géntranszkripció, az egynukleotidos variáció, a kópiaszám variáció és az epigenetikus citozin-metiláció genomszintű jellemzésére. Genomikai magunk a piac legrobusztusabb és legpontosabb módszerét alkalmazza &ndash&ndashthe Illumina BeadArray platformon.

Hagyományosan a microarray-ek rövid DNS-szálakkal nyomtatott üveglemezek voltak. Ennek a módszernek komoly hátrányai vannak, mint például az egyenetlen folt morfológiája, a szpotpozícióból adódó jeltorzítás és az alacsony tervezési rugalmasság. A BeadArrays a microarray technológia egyedülálló megközelítése, mikrométeres lyukakkal ellátott üveglemezeket használva oligonukleotiddal bevont gyöngyök elhelyezésére. A BeadArrays szabványos tömbként használatos, kivéve a szkenner által végrehajtott molekuláris dekódolási lépést.

A BeadArray platform genotipizálásra, géntranszkripció mennyiségi meghatározására és citozin metilációra használható.

A humán genotipizálási vizsgálatokat leggyakrabban az Infinium HD segítségével végzik OmniExpress (750 000 SNP) vagy Omni2.5-8 tömbök (2,4 millió SNP) használatával. Ezek a chipek másolatszám-változat becslésre (CNV) is képesek. Egyedi tartalom chipek a Genome Wide Association Studies (GWAS) számára is elérhetők. További információért kérjük, vegye fel velünk a kapcsolatot projektje részleteivel.

Génexpresszió-elemző chipek állnak rendelkezésre emberek, egerek és patkányok számára. Minden chip tartalmazza az összes ismert gént és sok szabályozó RNS-t. 2012 márciusától az Illumina beszüntette a mikroRNS-chipeket és az egyedi génexpressziós szolgáltatásokat.

A humán minták (beleértve az őssejteket és a tumorsejteket) genomszintű metilációs szkennelését a humán metilációs 450K array segítségével lehet elvégezni. Ez a tömb lefedi a CpG szigeteket, a promoterekben ismerten metilált helyeket, a DNáz-túlérzékeny helyeket és a miRNS promoter régiókat.

Tudjon meg többet a formalinnal fixált, paraffinba ágyazott mintákról, amelyeket genotipizálási vizsgálatokhoz lehet használni


A Science Park következő generációs szekvenáló magja – Smithville

A University of Texas MD Anderson Cancer Center Science Park Next-Generation Sequencing (NGS) Létesítményét 2012-ben hozták létre, a CPRIT 6 millió dolláros Core Facility Support Award támogatásával. A létesítmény támogatását 2016-ban versenyszerűen megújították egy további 5 millió dolláros CPRIT Core Facility Support Díjjal. Létesítményünk egy regionális NGS-forrás Texas középső részén, amely támogatja az innovatív és nagy hatású rákkutatást, amely kiterjedt NGS DNS- vagy RNS-szekvenálási képességeket igényel. NGS-létesítményünk több mint 40 rákkutatóból álló felhasználói csoport köré épül, akik az MD Anderson Science Parkból és a houstoni campusokról, UT Austin, UT Medical School Houston, Baylor College of Medicine, The Methodist Hospital Research Institute, Rice University, Texas A&M és Texas. Állami Egyetem - San Marcos. Más képzett kutatók a Texas középső régiójában hozzáférhetnek az NGS-létesítmény szolgáltatásaihoz, a szekvenszeren rendelkezésre álló idő függvényében. Számos szekvenálási protokollt hoztunk létre, beleértve az alacsony bemeneti minták és a hozzájuk kapcsolódó bioinformatikai csővezetékek protokolljait. Továbbra is új képességekkel bővítjük felhasználói csoportunk kutatási igényei alapján.

Ennek a magnak a használatához a finanszírozási forrástól függetlenül el kell ismerni a CPRIT Core Facility Support Grants-t (#RP120348 és #RP170002) a kiadványaiban.


A közvetlen RNS-szekvenálás jelenlegi állapota - Biológia

A REPAIRtoire egy online adatbázis a DNS-károsodások és -javítások rendszerbiológiájához. Az adatbázis a következő típusú információkat gyűjti és rendszerezi: (i) a környezeti mutagén és citotoxikus ágensekhez kapcsolódó DNS-károsodások, (ii) a károsodás eltávolításában szerepet játszó egyedi folyamatokat és enzimreakciókat tartalmazó útvonalak, (iii) a DNS-javításban részt vevő fehérjék, ill. (iv) a DNS-javító fehérjéket kódoló gének mutációival korrelált betegségek. A DNS-javítási és tolerancia-útvonalak grafikonok formájában és táblázatos formában vannak ábrázolva az egyes javítási lépések és a megfelelő fehérjék leírásával, az egyes bejegyzések pedig kereszthivatkozásokat tartalmaznak a támogató irodalomra és az elsődleges adatbázisokra. Ezen túlmenően online elérhető egy eszköz egyedi DNS-fehérje komplexek rajzolására.

A SpliProt3D egy online adatbázis, amely az emberi spliceoszóma fehérjéinek reprezentatív, kísérletileg meghatározott és számítással előrejelzett szerkezeteit tartalmazza.

A MODOMICS az első átfogó adatbázis-rendszer az RNS-módosítások rendszerbiológiájához. Integrálja a módosított nukleozidok kémiai szerkezetére vonatkozó információkat, RNS-szekvenciákban való elhelyezkedésüket, bioszintézis útjait és a megfelelő reakciókat végrehajtó enzimeket (beleértve a rendelkezésre álló fehérjeszekvencia- és szerkezetadatokat). Szakirodalmi információkat és más adatbázisokhoz mutató hivatkozásokat is tartalmaz. Az adatbázis lekérdezhető a nukleozid típusa (pl. A, G, C, U, I, m1A, nm5s2U stb.), az RNS típusa, az adott nukleozid pozíciója, a reakció típusa (pl. metilezés, tiolálás, dezamináció, stb.) alapján. stb.), valamint a kérdéses enzim neve vagy szekvenciája. Az adatmegjelenítés lehetőségei közé tartoznak a lekérdezési nukleozidot tartalmazó útvonalak grafikonjai, az RNS-szekvenciák többszörös szekvencia-illesztése, valamint az enzim- és irodalmi adatokkal ellátott táblázatos formák. A MODOMICS tartalma a világhálón keresztül érhető el: http://genesilico.pl/modomics/

Az RNA Bricks az RNS 3D szerkezeti motívumainak és kapcsolataik adatbázisa önmagukkal és fehérjékkel egyaránt. Az adatbázis szerkezet-minőségi pontszámokat és eszközöket biztosít az RNS 3D struktúra kereséséhez és összehasonlításához.

Az RNAarchitecture egy olyan adatbázis, amely átfogó leírást ad a strukturált, nem kódoló RNS-ek ismert családjai közötti kapcsolatokról, a szerkezeti hasonlóságokra összpontosítva. Az osztályozás hierarchikus és hasonló a fehérjeszerkezetek SCOP és CATH adatbázisaiban használt rendszerhez. Központi szintje a Family, amely az Rfam katalógusra épít, és szorosan kapcsolódó RNS-eket gyűjt össze. A családok konszenzusos struktúráit csökkentett másodlagos struktúra-reprezentációval írjuk le. Az evolúciósan rokon Családok szupercsaládokba vannak csoportosítva. A hasonló szerkezetek tovább csoportosulnak az Architektúrákba. A legmagasabb szint, az osztály, a családokat nagyon széles szerkezeti kategóriákba rendezi, mint például az egyszerű vagy összetett szerkezetű RNS-ek. A hierarchia különböző szintjein lévő egyes csoportok jelenleg &ldquounclassified&rdquo címkével vannak ellátva. Minden kísérletileg meghatározott 3D-s szerkezettel rendelkező családhoz tartozik egy reprezentatív. Az RNAarchitektúra az RNS 3D szerkezetének elméleti modelljeit is bemutatja, és nyitott szerkezeti modellek benyújtására a felhasználók számára. Más adatbázisokhoz képest az RNArchitecture egyedülálló abban, hogy a szerkezet alapú RNS osztályozásra összpontosít, és platformot biztosít az RNS 3D szerkezeti előrejelzéseinek tárolására. Az RNArchitecture a http://iimcb.genesilico.pl/RNArchitecture/ címen érhető el.

*A besorolás várhatóan fejlődni fog, amint új adatok állnak rendelkezésre, és szeretnénk minden érdekelt felet arra ösztönözni, hogy nyújtsa be fejlesztési javaslatait, valamint 3D szerkezeti előrejelzéseiket*

Az érintkezések kétdimenziós térképei összefoglalják az aminosavak közötti kölcsönhatásokat a szerkezetben. Felfedik a másodlagos és szuperszekunder struktúrák közötti kölcsönhatás jellegzetes mintázatait, és nagyon vonzóak a vizuális elemzéshez. Könnyen kiszámítható két struktúra maradékkontaktus-térképének átfedése, ami érzékeny mérést ad a fehérjeszerkezet hasonlóságára.

Kidolgoztunk egy módszert az RNS-struktúrák 3D homológia modellezésére. Páronkénti szekvencia-illesztést és szerkezeti sablont igényel a cél-RNS-szekvencia 3D-s szerkezeti modelljének létrehozása teljesen automatizált vagy script-alapú megközelítéssel. A ModeRNS 115 különböző nukleotid-módosítás kezelésére és hiányosságok áthidalására képes egy kiterjedt fragmenskönyvtárból származó fragmentumok segítségével.

Az RNAmap2D egy szoftvereszköz, amellyel a felhasználó által definiált kritériumok alapján számíthatók ki kontaktus- és távolságtérképek, valamint bizonyos mértékig kapcsolati térképpárok vagy -sorozatok mennyiségi összehasonlítása és az eredmények megjelenítése.

A Filtrest3D egy program a fehérjeszerkezet vagy fehérje-ligandum szerkezet nagyszámú alternatív modelljének megkülönböztetésére az alacsony felbontású kísérleti elemzésekből (például keresztkötések, mutagenezis, cirkuláris dikrozmus stb.) származó korlátozásokkal szemben, valamint számítási előrejelzésekből (pl. oldószer hozzáférhetőség, aminosav-kontaktus térképek).

A PyRy3D egy szoftvereszköz nagy makromolekuláris komplexek struktúráinak modellezésére. Monte Carlo szimulációt használ a konformációs tér mintavételére és az összetett komponensszerkezetek sűrűségtérképhez való legjobb illeszkedésének azonosítására. A komplex építési folyamat a kísérletekből származó távolságkorlátozásokon alapul.

Két közepes felbontású, tudásalapú potenciált dolgoztunk ki a dokkolás útján kapott fehérje-RNS modellek pontozására: a kvázi-kémiai potenciált (QUASI-RNP) és a Decoys As the Reference State potenciált (DARS-RNP). Mindkét potenciál durva szemcsés reprezentációt használ mind az RNS, mind a fehérje molekulák esetében, és képes kezelni a poszttranszkripciósan módosított aminosavakat tartalmazó RNS-struktúrákat. Teszteinkben, amelyek ezeket a módszereket más publikált potenciálokkal hasonlították össze, a DARS-RNP mutatta a legmagasabb képességet a natív jellegű struktúrák azonosítására.

SimRNA - egy eszköz az RNS konformációs dinamikájának szimulációjához, beleértve az RNS 3D szerkezetének előrejelzését

A SupeRNAlign egy eszköz az RNS 3D struktúrák rugalmas szuperpozíciójához. Programunk egy iteratív algoritmust valósít meg, amely az RNS-struktúrákat töredékekre bontja és a meglévő eszközök segítségével egymásra helyezi (jelenleg R3D Align). Végül az egymásra helyezett struktúrákat a rendszer egy .pdb fájlba menti, és létrehoz egy szekvencia-illesztést.

A QRNAS az AMBER szimulációs módszer kiterjesztése, további kifejezésekkel, amelyek explicit hidrogénkötésekhez, ko-síkú bázispárokhoz, gerincszabályozáshoz és egyéni korlátozásokhoz kapcsolódnak. A QRNS képes RNS-t, DNS-t, kimérákat és ezek hibridjeit kezelni, és lehetővé teszi a módosított aminosavakat tartalmazó nukleinsavak modellezését.

A SimRNAweb egy webszerver felület a SimRNA módszerhez az RNS 3D szerkezetmodellezési módszeréhez

A GeneSilico MetaServer egy átjáró számos, harmadik féltől származó fehérjeszerkezet-előrejelzési módszerhez (domének azonosítása, másodlagos szerkezet előrejelzése, hajtás-felismerés és végül 3D-s modellgenerálás). A felhasználók egyetlen kattintással elküldhetik a fehérjeszekvenciát (vagy igazítást), majd elemezhetik a sokféle módszerrel generált eredmények összesítését, végül a „konszenzusos” megközelítés szerint megjósolhatják a fehérje szerkezetét.

Ez az eszköz fehérjemodelleket épít fel a Fold-Recognition illesztések fragmenseinek rekombinációjával. A felhasználók kiválaszthatnak egy sor igazítást a MetaServer kimenetéből, vagy megadhatják saját igazításukat. A program alternatív modelleket generál, azonosítja azokat a fragmentumokat, amelyek vagy konszenzusos konformációt mutatnak a különböző modellekben, vagy - konszenzus hiányában - az aminosavak viszonylag legjobb kompatibilitását mutatják a modell többi részének környezetével. Ezeket a fragmentumokat rekombináljuk egy hibrid modell létrehozása érdekében, amelyet tovább optimalizálunk a nem konszenzusos régiókban történő alternatív illesztések kipróbálásával a szekvencia-struktúra kompatibilitás javítása érdekében.

Ez az egyszerű szerver megkönnyíti a háromdimenziós (3D) fehérjeszerkezetek vizuális bemutatását. Ez egy átjáró számos fehérjeszerkezet-értékelési módszerhez (ANOLEA, PROSAII, PROVE vagy VERIFY3D), de azonosítja az eltemetett maradványokat és ábrázolja a szekvencia megőrzését. Bemenetként egy PDB-fájlt, és opcionálisan egy többszörös sorozat-illesztést igényel. Kimenetként a szerver egy fájlt ad vissza, amelyben a B-faktor oszlopot a kiválasztott paraméter értékeivel helyettesíti (szerkezet minősége, maradvány eltemetése vagy konzervációja). Ezek az értékek színként jeleníthetők meg olyan szerkezetnézegetőkkel, mint a RASMOL vagy a SWISS PDB VIEWER.

Ez a szerver „alfa” verziója, amely a fehérjeszerkezet számos alternatív modelljének megkülönböztetését szolgálja az alacsony felbontású kísérleti elemzésekből (például keresztkötések, mutagenezis, körkörös dikrozmus stb.) származó korlátozásokkal szemben. mint a számítási előrejelzésekből (pl. oldószer hozzáférhetőség, aminosav-kontaktus térképek).

Míg a legtöbb filogenetikai módszer a fákat szekvencia-illesztések alapján számítja ki, ez a szerver (STRUcture CLAssification) lehetővé teszi a fehérjestruktúrák használatát. A preferált bemenet a SWISS PDB VIEWER-ből exportált fehérje koordináták összehangolása. A felhasználó megadja a távolság határértékét, és kiválasztja, hogy milyen méréseket kell használni a fehérjeszerkezetek közötti "evolúciós távolságok" kiszámításához. A szerver gyökértelen fák sorozatát adja vissza NEXUS formátumban és a megfelelő távolságmátrixokat, valamint egy konszenzusfát. Ez a módszer a „homológia szürkületi zónájában” a leghasznosabb, ahol az aminosavszekvenciák túlságosan eltérnek ahhoz, hogy megbízható kapcsolatokat tudjanak biztosítani.

A CompaRNA webszerver folyamatos referenciaértéket biztosít az automatizált önálló és webszerver-módszerek között az RNS másodlagos szerkezetének előrejelzéséhez. Az EVA és a Livebench szerverek ihlették a fehérjeszerkezet-előrejelző eszközök benchmarkingjához, amelyek nagymértékben hozzájárultak a szerkezeti bioinformatika területén elért fejlődéshez. A CompaRNA célja, hogy felmérje a technika állását az RNS-struktúra előrejelzésében, részletes képet adjon arról, hogy mi lehetséges a rendelkezésre álló eszközökkel, hol történik előrelépés, és milyen jelentősebb problémák maradtak fenn. A CompaRNA szerver értékes erőforrás minden kutató számára, aki az RNS-struktúra előrejelzési módszereinek alkalmazására és fejlesztésére összpontosítja figyelmét.

A ModeRNA szerver egy online eszköz az RNS 3D szerkezetének összehasonlító megközelítéssel történő modellezéséhez, amely egy sablon RNS struktúrán és egy felhasználó által meghatározott cél-templát szekvencia illesztésen alapul. Lehetőséget kínál potenciális sablonok keresésére, a célszekvenciának megfelelően. A szerver eszközöket is biztosít az RNS-struktúra fájlok elemzéséhez, szerkesztéséhez és formázásához. Megkönnyíti a ModeRNA szoftver használatát, és új lehetőségeket kínál az önálló programhoz képest.

A MetalionRNA egy webszerver a fémionok (magnézium, nátrium és kálium) előrejelzésére RNS 3D-struktúrákban, a kísérletileg megoldott RNS-struktúrákban megfigyelt kötőhelyek elemzéséből kikövetkeztetett statisztikai potenciál alapján. A szerver képes megjósolni a DNS-struktúrák Mg2+-kötő helyeit is.

A MetaGramLocN egy módszer a Gram-negatív fehérjék szubcelluláris lokalizációjának előrejelzésére. A MetaGramLocN egy átjáró számos elsődleges predikciós módszerhez (különböző típusok: szignálpeptid, béta-hordó, transzmembrán hélixek és szubcelluláris lokalizációs prediktorok).A MetaGramLocN integrálja az elsődleges módszereket, és kimeneteik alapján átfogó konszenzus-előrejelzést biztosít. A fehérjeszekvenciájának előrejelzéséhez használja a Submit vagy SOAP klienst. Referenciánkban a MetaLocGramN jobban teljesített más SCL prediktív módszerekkel összehasonlítva, mivel az átlagos Matthews-korrelációs együttható elérte a 0,806-ot, ami 12%-kal javította a prediktív képességet (a PSORTb3-hoz képest). .

A fehérjék nukleinsavakkal végzett kokristályosítási kísérletei nem garantálják, hogy mindkét komponens jelen van a kristályban. Míg PhD-hallgatóként dolgozott Matthias Bochtlerrel, Grzegorz Chojnowski kifejlesztette a DIBER-t – egy olyan módszert, amellyel a diffrakciós adatokból megjósolható a kristálytartalom (DNS-fehérje? vagy mindkettő?). Most közösen kifejlesztettük a RIBER-t, amelyet akkor kell használni, amikor a fehérje és az RNS a kristályosodási cseppben van. A kombinált RIBER/DIBER programcsomag a gépi tanulási technikákra épít, hogy megbízható, kvantitatív előrejelzéseket készítsen a kristálytartalomról a nem szakértő felhasználók és a nagy áteresztőképességű krisztallográfia számára. A RIBER/DIBER legalább 3,0 Å felbontású diffrakciós adatokat igényel MTZ vagy CIF formátumban.

A MinkoFit3D egy módszer makromolekuláris összeállítások vagy komponenseik elektronsűrűségi térképekbe illesztésére. Megközelítésünk a szerkezet két poliéderes felületének Minkowski-összeghatárából és annak térképéből kikövetkeztetett „szoros átjárók” keresésén alapul. A kezdeti illesztést követően vagy egy robusztus nyers erőt, vagy egy genetikai algoritmust használnak a kezdeti összeállítás felépítéséhez, és többtestes finomítást alkalmaznak a közvetlen elektronsűrűség-térben.

A GeneSilico MetaServer egy átjáró számos, harmadik féltől származó fehérjeszerkezet-előrejelzési módszerhez (domének azonosítása, másodlagos szerkezet előrejelzése, hajtás-felismerés és végül 3D-s modellgenerálás). A felhasználók egyetlen kattintással elküldhetik a fehérjeszekvenciát (vagy igazítást), majd elemezhetik a sokféle módszerrel generált eredmények összesítését, végül a „konszenzusos” megközelítés szerint megjósolhatják a fehérje szerkezetét.

Az RNS-metaszerver hozzáférést biztosít az RNS másodlagos szerkezetének előrejelzésére egyszekvenciás (21) és összehasonlító módszerekhez (14). Felveszi az Ön bemeneti RNS-szekvenciáját, elküldi a szerverre helyileg telepített másodlagos szerkezet-precíziós programoknak, összegyűjti az összes előrejelzett struktúrát, és az RNAmetaserver által kiszámított meta-előrejelzéssel együtt megjeleníti azokat az eredmények között. A szerver által generált meta-előrejelzés a lehető legjobb másodlagos struktúra egy lekérdező RNS-szekvenciához a CompaRNA benchmarkok szerint

A QA-RecombineIt webes felületet biztosít a fehérje 3D-s szerkezeti modellek minőségének értékeléséhez, és több bemeneti modell töredékeinek egyesítésével javítja a modellek pontosságát. Az első szakaszban (QA-mód) a szerverünk előrejelzi a bemeneti modellek globális minőségét, és becsléseket ad a lokális minőségre, mint a modellekben szereplő C-α atomok és az ismeretlen natív szerkezet megfelelő atomjai közötti eltérésre. A bemeneti modellekkel együtt ezek az előrejelzések a második szakasz (RecombineIt-mód) bemenetévé válnak, amelyben a többinél jobbnak jósolt töredékeket megfontoltan kombinálják hibrid (konszenzusos) modellek létrehozására. Végül a hibrid modelleket a minőségbiztosítási módban implementált MQAP-ok pontozzák, majd bemutatják a felhasználónak.

Az NPDock egy webszerver fehérje-RNS és fehérje-DNS komplex struktúrák modellezésére. Egyesíti a GRAMM-et a globális makromolekuláris dokkoláshoz, a pontozáshoz statisztikai potenciállal, a legjobb pontszámot elért struktúrák csoportosításához és a helyi finomításhoz.

A ClaRNA egy új módszer az érintkezők számítási osztályozására RNS 3D struktúrákban. A program egyedi jellemzői a tökéletlen érintkezők azonosítása és a durva szemcsés modellek feldolgozása. Egy lekérdezési struktúrában a térben közeli ribonukleotid-maradékok minden dublettjét összehasonlítják a nagyszámú kísérletileg meghatározott RNS-struktúra elemzésével kapott referencia-dublettek klasztereivel, és hozzárendelnek egy pontszámot, amely leírja egy vagy több ismert típusú kapcsolathoz való hasonlóságát, beleértve a párosítást is. , halmozás, bázis-foszfát és bázis-ribóz kölcsönhatások.

A BrickworX webszerver RNS- és DNS-modelleket épít elektronsűrűség-térképekké, akár 4 Å felbontással. A bemenetre a programnak szüksége van egy MTZ fájlra a szerkezeti tényező amplitúdóival és fázisaival.

A GDFuzz3D egy fehérje 3D szerkezeti modellezési módszere, amely a fehérjeszekvenciából és az aminosavmaradékok közötti kapcsolatok térképéből indul ki. Képes kezelni az előre jelzett térképeket, amelyek tartalmazzák például az összes maradvány közötti érintkezés valószínűségét, és a hibásan előre jelzett kapcsolatok nagy részét. Nem alkalmas struktúrák előrejelzésére olyan térképek alapján, amelyek csak néhány előrejelzett kapcsolattal rendelkeznek.

A program bemenetként veszi a módosítatlan tRNS szekvenciák készletét és egy sejt proteomjának megfelelő fehérjeszekvenciák készletét, azonosítja az összes RNS-maradékot, amely megfelel az ismert enzimekkel rendelkező ismert módosítási helyeknek, megkeresi az ismert tRNS módosító enzimek homológjait, és feltérképezi. az RNS-módosítás ismert útjaira vonatkozó előrejelzések, hogy azonosítsák az elméletileg lehetséges módosítási reakciókat a lekérdező tRNS-ek összes pozíciójában.

A SupeRNAlign egy eszköz az RNS 3D struktúrák rugalmas szuperpozíciójához. Programunk egy iteratív algoritmust valósít meg, amely az RNS-struktúrákat töredékekre bontja és a meglévő eszközök segítségével egymásra helyezi (jelenleg R3D Align). Végül az egymásra helyezett struktúrákat a rendszer egy .pdb fájlba menti, és létrehoz egy szekvencia-illesztést.


Nézd meg a videót: Građani Cetinja poručili da neće pustiti predstavnike SPC-a da prođu blokade (Január 2022).